动脉三级淋巴器官编码动脉粥样硬化中一对致病性高亲和力自身抗体—自身抗原对

《Nature Cardiovascular Research》：Artery tertiary lymphoid organs encode a pathogenic high-affinity autoantibody?autoantigen pair in atherosclerosis

　　

动脉三级淋巴器官（ATLO）在动脉粥样硬化中出现，动脉粥样硬化是一种具有自身免疫成分的慢性炎性动脉疾病。然而，疾病相关自身免疫B细胞是否在ATLO中出现仍未知。在本研究中，研究人员从健康及高动脉粥样硬化负荷小鼠的ATLO与淋巴结中分离生发中心（GC）B细胞，表达克隆60个自身抗体并筛选其对动脉壁的反应性。ATLO GC B细胞来源的自身抗体相较于两种基因型淋巴结中的对应抗体，偏向动脉粥样硬化相关自身抗原。一个ATLO GC B细胞来源自身抗体（命名为A6）以高亲和力结合组蛋白2B（H2B）。H2B疫苗接种与A6过继转移均加速动脉粥样硬化，揭示一对致病性自身抗体—自身抗原对。机制上，ATLO特异性呈现扭曲的B细胞活化与免疫耐受检查点调控基因表达谱。在人队列中，循环抗H2B抗体滴度与人的主动脉钙化正相关。研究人员认为，ATLO容纳一个失调的免疫耐受环境，允许表达促进动脉粥样硬化的致病性自身抗体的自身反应性B细胞存在。

论文解读：《Nature Cardiovascular Research》发表研究揭示动脉三级淋巴器官中的致病性自身抗体—自身抗原对

研究背景与立项依据

动脉粥样硬化是心梗与卒中主要病理基础，被公认为慢性炎症性疾病，但其自身免疫病因未明。已有研究报道动脉粥样硬化相关自身反应性T细胞与B细胞，以及多种自身抗原和自身抗体：如抗氧化低密度脂蛋白（oxLDL）、抗乙醛脱氢酶4A1（ALDH4A1）多为保护性或低亲和力；抗β2糖蛋白I（β2GPI）、抗GRP78、抗CXCR3等可促进病变但亲和力未定；抗Hsp60、Hsp70由疫苗诱导后加重病变，但均未达到Witebsky—Rose标准所要求的“明确特异性与高亲和力致病性自身抗体—自身抗原对”。三级淋巴器官（TLO）在慢性炎症状态下出现，动脉TLO（ATLO）在小鼠与人的冠脉、颈动脉和腹主动脉病变段可见，晚期含活化B细胞滤泡、GC和浆细胞（PC）巢。前期显示ATLO中T细胞克隆扩增，但B细胞自身反应性与亲和成熟是否由ATLO驱动不清。鉴于外周耐受检查点失效可致自身免疫病，研究人员聚焦ATLO中B细胞/PC转录组与耐受缺陷，以验证动脉粥样硬化具自身免疫病因的假说。

主要关键技术方法

研究人员采用老年野生型（WT）与Apoe^?/?小鼠肾淋巴结（RLN）及Apoe^?/?小鼠ATLO为样本来源，配对单细跑RNA测序与B细胞受体测序（scRNA-seq/scBCR-seq）绘制B细胞亚群与克隆；将GC B细胞配对Ig重链（IgH）/轻链（IgL）表达克隆为重组单抗并筛查动脉壁/斑块反应性；以免疫沉淀联合质谱鉴定自身抗原；用表面等离子共振（SPR）与生物膜干涉（BLI）测亲和力；以H2B疫苗接种和A6过继转移做体内致病验证；并设人队列检测循环抗H2B滴度与主动脉钙化关联。

研究结果

B cells and PCs in ATLOs

通过对RLN与ATLO的CD45⁺白细胞分选与质控，获12854个B细胞转录组。UMAP分出初始B、新活化B（Nac B）、早GC B、晚GC B、记忆B（Mem B）与PC。ATLO中早GC B、Mem B、PC比例高于WT与Apoe^?/? RLN。ATLO B细胞高表达Nfkbia、Relb、Cxcr4、Cd86，低表达Cd22、Fas；蛋白层确认CXCR4与RELB高、BCL6低。ATLO PC的体细胞高频突变（SHM）高于RLN PC，提示加速GC—PC分化；ATLO晚GC克隆优势增强，但类别转换重组（CSR）在早—晚GC间失常，PC高表达Ig分泌与未折叠蛋白反应转录本。

Dysregulated GC B cells in ATLOs

ATLO GC见于重病变Apoe^?/?小鼠，呈散在T—B簇到含CD35⁺滤泡树突细胞（FDC）的III期结构，明暗区（LZ/DZ）异常：LZ增多、DZ减少。整合已发表GC数据集后，ATLO GC B细胞DZ的SHM与同型转换最低。转录上ATLO GC B上调Fc受体、NF-κB、干扰素相关基因，下调Cd22与Aicda；高表达Cd44、Cd86、Kras、Ccnd2、Nfkb1、Rel、Irf4、Myc、Cxcr4，低表达Bcl6、Irf8、Mef2b、Foxo1、Aicda、BAFFR。ATLO滤泡辅助T（T_FH）细胞Cd40l等活化信号增强；GC B向PC分化基因Irf4、Prdm1、Xbp1上调，Pax5、Bach2、Irf8、Bcl6下调。GSEA显示ATLO LZ富集CD4 T活化与耐受调控、负向富集DNA复制/BCR信号；DZ正向富集TNF与IL-1β产生、负向富集SHM。

The GC?PC differentiation pathway in ATLOs

利用BCR系统发育树连接Nac B、GC B、Mem B与PC，研究人员发现WT与Apoe^?/? RLN轨迹相似，而ATLO中GC B—PC分支显著增强；初始B与PC共享BCR在ATLO中大为减少，支持ATLO存在加速GC B—PC分化通路而非单纯GC非依赖途径扩张。

ATLO GC-derived autoantibodies skew to arterial wall and atherosclerotic plaque-reacting autoantigens

从WT RLN、Apoe^?/? RLN与ATLO GC各取/建30个重组抗体。多反应性（胰岛素、dsDNA、LPS中≥2）在WT RLN为54%、Apoe^?/? RLN为41%，ATLO仅10%，说明ATLO GC经历亲和成熟后特异性增强。动脉组织染色显示ATLO GC来源抗体67%组织反应、其中75%为斑块反应；WT RLN无斑块反应抗体，Apoe^?/? RLN仅36%斑块反应。ATLO GC偏好产生动脉壁/斑块反应性自身抗体。

ATLO GCs encode a high-affinity autoantibody in atherosclerosis

在15个ATLO斑块反应抗体中，A6满足斑块反应、抗原明确、人斑块存在、Western印证。A6核染小鼠与人颈动脉斑块， pulls down出10—15 kDa蛋白，质谱定为H2B。H2B在鼠人间氨基酸一致。SPR/BLI示A6对重组H2B亲和力25—30 nM；未突变祖先抗体亲和力更低，证明A6于ATLO GC经SHM获得高亲和力。RLN GC中也见RA36、RA39、RA40抗H2B：RA36低亲和；RA39/RA40胚系高亲和、GC后下降，属“redeption（救赎）”耐受机制。ATLO中高亲和A6未被清除，提示 redemption 失调。

Humoral H2B autoimmunity promotes atherosclerosis in mice

Apoe^?/?老化与AAV-PCSK9小鼠血清抗H2B IgG1随病变上升，斑块内可检内源抗H2B。H2B疫苗接种年轻Apoe^?/?促动脉粥样硬化；A6过继转移同样加速病变，证实H2B—A6为致病对。

讨论与结论翻译

讨论指出，ATLO不同于次级淋巴器官（SLO），其GC呈现B细胞活化增强、抑制性检查点Cd22/Fas低下、SHM与CSR调控异常、T_FH与髓样细胞互作增强，构成容许自身反应性B细胞存活的失调耐受微环境。既往保护性或未知亲和力抗体不能证明动脉粥样硬化符合自身免疫病标准，而本研究给出内源性、定义明确、高亲和力的自身抗体—自身抗原对（抗H2B A6—H2B），并用人队列循环抗H2B滴度与主动脉钙化正相关外推至临床。

研究结论：ATLOs harbor a dysregulated immune tolerance environment permissive for autoreactive B cells that express pathogenic autoantibodies promoting atherosclerosis.（ATLO容纳一个失调的免疫耐受环境，容许表达促进动脉粥样硬化的致病性自身抗体的自身反应性B细胞存在。）