《Plant Physiology and Biochemistry》：Identification of
bHLHs based on transcriptome and molecular mechanism of transcription factor
CabHLH118 regulating anthocyanin biosynthesis in chili (
Capsicum annuum L.)fruit
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摘要
bHLH家族被认为是植物中第二大类的转录因子，在多种生物学过程中发挥重要作用，尤其在颜色调控方面。前期研究表明，bHLH家族基因显著参与了辣椒果实颜色变异相关基因的筛选。对预测的bHLH家族基因进一步分析发现，CabHLH118与飞燕草素（delphi
摘要
bHLH家族被认为是植物中第二大类的转录因子，在多种生物学过程中发挥重要作用，尤其在颜色调控方面。前期研究表明，bHLH家族基因显著参与了辣椒果实颜色变异相关基因的筛选。对预测的bHLH家族基因进一步分析发现，CabHLH118与飞燕草素（delphinidin）之间存在高度相关性，后续检测表明CabHLH118定位于细胞核，具有转录激活活性，但在酵母中缺乏自激活活性。在辣椒CS03果实中沉默或瞬时过表达CabHLH118，均导致显著的表型变化，并伴随花青素积累的显著减少或增加。与此一致的是，CabHLH118的表达水平出现显著下调或上调，花青素生物合成途径中的结构基因也呈现相应变化。酵母单杂交（yeast one-hybrid, Y1H）和双荧光素酶（dual-luciferase）实验证明，CabHLH118能够与CaF3'H的上游启动子结合并促进花青素的形成。此外，CabHLH118可能响应蓝光以增强花青素的生物合成，尽管其潜在机制仍需进一步验证。综上所述，这些发现有助于理解茄科植物中花青素的调控机制。
基于转录组与分子机制的辣椒bHLH转录因子鉴定及CabHLH118调控花青素生物合成研究解读
**1. 研究背景与科学问题**
花青素（anthocyanin）是植物中一类重要的类黄酮次生代谢产物，广泛存在于被子植物表皮细胞的液泡中，赋予花、叶、果实等器官丰富的色彩。在植物生长发育过程中，花青素的积累不仅具有吸引昆虫授粉的生物学功能，还能帮助植物抵御低温、高盐、干旱、紫外线辐射等非生物胁迫。对人类而言，花青素具有显著的健康益处，能够有效保护细胞和组织免受活性氧引起的氧化损伤，因而被视为重要的功能性成分。在农业生产中，花青素的存在增强了作物的观赏性，从而提升其商业价值。辣椒（*Capsicum annuum* L.）作为全球广泛种植的重要蔬菜作物，富含维生素C、辣椒素、类胡萝卜素等营养物质，特别是紫色辣椒未成熟果实中含有大量花青素等次生代谢产物，这些物质构成了辣椒品质的重要因素。
花青素的生物合成调控主要发生在结构基因的转录水平，受多种转录因子调控，包括MYB、bHLH、WD40、NAC、WRKY、ERF、bZIP、BBX等。其中，由MYB、bHLH和WD40蛋白组成的MBW复合物在花青素生物合成调控中发挥尤为关键的作用，该复合物能够结合结构基因启动子中的相应顺式作用元件，激活和/或抑制下游结构基因的表达。bHLH蛋白作为植物中第二大类转录因子，在调控次生代谢、细胞分化、植物生长发育、根对铁的吸收、光信号转导和激素响应等多种生物学过程中发挥广泛作用。bHLH转录因子调控花青素合成有两种方式：一是依赖MYB/WD40转录因子形成MBW复合物进行转录调控，这是bHLH调控花青素生物合成的主要机制；二是单独与结构基因启动子结合进行直接调控。然而，关于单独调控辣椒花青素生物合成的bHLH转录因子的报道较少。
通过三种不同颜色辣椒早期阶段的转录组和非靶向代谢组联合分析发现，bHLH家族含有大量差异表达基因，且与飞燕草素表现出高相关系数。紫色辣椒是一种珍稀的种质资源，品种CS03是一种富含花青素的紫色辣椒。因此，利用辣椒CS03研究花青素的生物合成与调控，对于培育紫色辣椒新品种及为未来遗传工程奠定基础具有重要意义。
**2. 主要技术方法**
研究人员利用转录组测序数据预测并鉴定了辣椒中的bHLH转录因子，通过进化树、基序和保守结构域分析确认其家族归属。采用农杆菌介导的瞬时转化技术在本氏烟草（*Nicotiana benthamiana*）叶片中进行亚细胞定位和双荧光素酶报告基因检测实验。利用病毒诱导的基因沉默（virus-induced gene silencing, VIGS）技术和农杆菌介导的瞬时过表达方法在辣椒CS03果实中进行基因功能验证。采用酵母单杂交（yeast one-hybrid, Y1H）和双荧光素酶（dual-luciferase）实验验证转录因子与靶标启动子的结合及转录激活能力。通过分光光度法测定总花青素含量，利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测基因表达水平。样本来源于云南农业大学蔬菜基地种植的辣椒品种CS03、CS29和L816。
**3. 研究结果**
3.1 不同发育阶段不同辣椒品种中CabHLHs的鉴定与表达模式分析
研究人员从三种辣椒品种的转录组数据中共预测到2,990个转录因子，其中355个在果实早期阶段被鉴定为差异表达基因，包括24个CabHLH家族基因。进化树、基序和保守结构域分析表明，几乎所有鉴定到的CabHLH都含有典型的螺旋-环-螺旋（helix-loop-helix）结构，确认其确实属于bHLH家族。其中，CabHLH118与CabHLH36和CabHLH162的亲缘关系最近，三者包含相同的基序且排列顺序一致。基于这些bHLH转录因子在辣椒三个不同发育阶段的表达水平热图分析显示，CaT2T03g02516（即CabHLH118）、CaT2T02g03311和CaT2T02g02180等基因在CS03幼果期（Y期）表达水平较高，而在其他阶段或其他辣椒品种中表达水平较低，这与三种辣椒阶段总花青素含量的变化趋势一致。基于花青素相关性网络系数分析，24个bHLH转录因子中有11个与花青素相关，其中10个与飞燕草素、矢车菊素及其糖苷呈正相关。排除表达水平相对较低的基因后，最终选择CaT2T03g02516（即CabHLH118）进行qRT-PCR验证，其表达趋势与转录组测序数据一致。
3.2 CabHLH118基因的克隆与特征分析
CabHLH118基因全长为741bp，在辣椒基因组数据库中的基因序列号为CaT2T03g02516，注释为转录因子bHLH118。为验证该基因的功能，研究人员在烟草中进行了亚细胞定位实验，结果显示CabHLH118定位于细胞核，表明其可能作为转录因子发挥作用。酵母自激活验证实验表明，阳性对照在SD/-Trp/-His/-Ade/X-α-Gal缺陷培养基上能够正常生长并变蓝，而阴性对照和pGBKT7-CabHLH118均无法正常生长，说明CabHLH118缺乏转录自激活活性。为进一步验证其转录激活功能，研究人员通过在本氏烟草叶片中的瞬时表达分析其对下游报告基因的调控效应，实验组的荧光强度强于对照组，表明CabHLH118能够结合UAS序列并激活下游荧光基因的表达。在不同发育阶段的辣椒CS03果实中，CabHLH118的表达水平存在差异，在转色期（S5期）表达水平最高，其次是幼果期（S1期），绿果期（S3期）表达水平最低。基于转录组数据和总花青素含量，推测CabHLH118可能在调控花青素生物合成中发挥重要作用。
3.3 辣椒果实中CabHLH118沉默与过表达的鉴定
采用病毒诱导的基因沉默（VIGS）技术对辣椒CS03果实进行基因功能鉴定。结果显示，与空载体pTRV对照相比，pTRV:CabHLH118果实沉默位点的总花青素积累显著减少（接种后7天），CabHLH118基因的相对表达水平也显著降低。相应地，花青素生物合成途径中主要结构基因如CaPAL、Ca4CL、CaCHS、CaF3'H、CaDFR、CaANS和CaUFGT的表达水平均显著降低。瞬时过表达CabHLH118后，辣椒CS03果实接种位点的颜色在接种后4天出现加深现象。总花青素含量测定显示花青素积累增加，同时CabHLH118基因的相对表达水平升高。此外，花青素生物合成途径中主要结构基因的相对表达水平均有不同程度的升高，其中CaPAL、Ca4CL和CaF3'H显著升高。
3.4 CabHLH118正向调控花青素生物合成的分子机制
基于上述沉默和过表达果实的特征分析，研究人员基本得出结论CabHLH118是花青素生物合成的正向调控因子，但其具体分子机制尚不清楚。酵母单杂交（Y1H）结果显示，CabHLH118能够与花青素生物合成途径结构基因CaF3'H的上游启动子结合，从而促进花青素的合成与积累。双荧光素酶报告基因检测的荧光成像结果显示，CabHLH118-62SK+CaF3'H-0800-LUC处理组表现出强烈的荧光响应，强于对照组，表明CabHLH118能够显著激活CaF3'H基因的转录活性。综合这些结果证明，CabHLH118是辣椒果实花青素生物合成的正向调控因子。
3.5 CabHLH118对蓝光响应的验证
研究人员还验证了CabHLH118是否响应特定类型的光照并影响花青素的生物合成。套袋处理后，紫色辣椒CS03的果实颜色变为纯白色；经蓝光和红光LED灯分别处理后，果实颜色加深，其中蓝光处理组更为明显。实时荧光定量验证显示，CabHLH118几乎不响应红光，但对蓝光有响应。蓝光处理1天后其表达水平开始升高，处理2天后表达水平达到峰值。此外，在蓝光处理3天、5天和7天后，其表达水平仍显著高于对照组和红光处理组。
**4. 讨论与结论**
bHLH转录因子家族成员在植物生物学过程的多个方面发挥重要作用。本研究发现的CabHLH118能够通过直接结合CaF3'H启动子来调控花青素的生物合成，这是一个新的发现，不同于以往研究中bHLH主要通过MYB转录因子相互作用来调控结构基因表达的机制。VIGS技术在本研究中被证明是辣椒基因功能验证的可行方法，但与稳定的遗传转化体系相比，VIGS存在沉默效率不均一、效果瞬时、可能产生脱靶多效性效应等局限性。因此，后续研究建议结合CRISPR/Cas9介导的完全敲除株系或稳定的RNAi转基因株系进行互补分析。
光照质量已被证明影响花青素的生物合成。本研究中，在蓝光（14小时蓝光/10小时黑暗）照射后，辣椒CS03果实中CabHLH118基因的表达水平较红光处理组显著升高，表明CabHLH118可能响应蓝光照射来调控花青素的生物合成。虽然本研究采用分光光度法估算了总花青素含量，但未来应用高效液相色谱（high-performance liquid chromatography, HPLC）分析主要花青素单体（如矢车菊素、飞燕草素等）将有助于阐明其差异积累的分子机制。同时，本研究的分子机制验证还不够深入，未来应补充凝胶迁移实验（electrophoretic mobility shift assay, EMSA）、酵母双杂交（yeast two-hybrid, Y2H）、双分子荧光互补（bimolecular fluorescence complementation, BiFC）等实验以阐明其调控机制。
综上所述，CabHLH118是一个定位于细胞核的转录因子，在辣椒CS03紫色果实中特异性表达。沉默或瞬时过表达CabHLH118均导致果实颜色发生明显变化。qRT-PCR分析证实，CabHLH118转录水平相应降低或升高，这与花青素生物合成结构基因的显著下调或上调相关。与此一致的是，总花青素含量出现相应变化，表明CabHLH118在辣椒果实花青素积累中发挥正向调控因子的作用。酵母单杂交和双荧光素酶报告基因实验进一步证明，CabHLH118直接结合CaF3'H启动子以激活其转录。此外，CabHLH118可能还参与介导蓝光诱导的花青素生物合成，但详细的调控机制仍有待阐明。该研究发表在《Plant Physiology and Biochemistry》期刊上，为理解茄科植物中花青素的调控机制提供了新的见解。
