丹叶大黄素减轻脓毒症相关性急性肾损伤并伴随铁死亡、炎症和NF-κB信号通路的调节

《Journal of Biochemical and Molecular Toxicology》：Rhapontigenin Alleviates Sepsis-Associated Acute Kidney Injury and Is Accompanied by Modulation of Ferroptosis, Inflammation, and NF-κB Signaling

　　

脓毒症相关性急性肾损伤（sepsis-associated acute kidney injury, SA-AKI）是危重症患者的常见并发症，且与高死亡率相关。证据表明，铁死亡相关的脂质过氧化和炎症反应参与肾损伤。丹叶大黄素（rhapontigenin, Rha）是一种具有抗氧化和抗炎特性的天然化合物，其在SA-AKI中的潜在作用尚未被直接研究。研究人员用Rha预处理HK-2细胞3小时，随后以10 ng/mL脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）刺激24小时，建立体外脓毒症相关损伤模型。采用CCK-8评估细胞活力。通过检测GPX₄和xCT表达、细胞内Fe²⁺、活性氧（reactive oxygen species, ROS）、丙二醛（malondialdehyde, MDA）以及BODIPY-C11检测的脂质ROS来评估铁死亡相关变化。使用Erastin和ferrostatin-1（Fer-1）进行药理学干预。采用ELISA定量炎症细胞因子（IL-1β、IL-6和TNF-α）。通过p-NF-κB/NF-κB和p-IκBα/IκBα比值及p65核定位评估NF-κB活化，并使用RANKL作为NF-κB激活剂。在体内，雄性C57BL/6J小鼠接受盲肠结扎穿刺（cecal ligation and puncture, CLP）以诱导SA-AKI。评估了Rha对肾组织学、肾损伤标志物、铁死亡相关指标、炎症细胞因子和NF-κB信号的影响。在0–80 μM的测试浓度范围内，未达到Rha的IC₅₀。5–40 μM的Rha对基础HK-2细胞活力无显著影响，而80 μM引起轻微降低。在LPS处理的HK-2细胞中，20和40 μM的Rha处理增加了细胞活力，降低了细胞内Fe²⁺、ROS、MDA和脂质ROS水平，并增加了GPX₄和xCT表达。Rha还减少了erastin诱导的Fe²⁺积累，而Fer-1降低了LPS处理细胞中的Fe²⁺和ROS水平，并增加了GPX₄和xCT表达。此外，Rha降低了IL-1β、IL-6和TNF-α水平，并减少了NF-κB磷酸化和p65核定位。RANKL部分逆转了Rha对p65核定位、细胞活力、Fe²⁺积累、ROS产生和炎症细胞因子水平的影响。在CLP小鼠中，25和50 mg/kg的Rha降低了血清NGAL、KIM-1、Scr和BUN水平，并降低了肾Fe²⁺、MDA和炎症细胞因子水平。在50 mg/kg剂量下，肾损伤评分显著降低。Rha减轻了实验性SA-AKI，并伴随铁死亡相关变化、炎症反应和NF-κB活化的减少。

丹叶大黄素在脓毒症相关急性肾损伤中的保护作用研究解读

脓毒症相关性急性肾损伤（SA-AKI）是重症监护病房中常见的严重并发症，约30%至50%的脓毒症患者会发生AKI，合并脓毒性休克时发生率可超过60%，且与高死亡率密切相关。目前治疗以支持性措施为主，如感染控制、液体复苏和器官支持，但缺乏直接针对关键病理过程的干预手段。近年研究发现，铁死亡（ferroptosis）作为一种铁依赖性的调节性细胞死亡形式，通过细胞内铁积累和脂质过氧化导致肾小管上皮细胞损伤，在SA-AKI发病中发挥重要作用；同时，过度激活的炎症反应，尤其是NF-κB信号通路介导的促炎细胞因子释放，进一步加重肾损伤。然而，针对这些过程的特异性治疗策略仍然有限。丹叶大黄素（Rha）是一种天然芪类化合物，具有抗氧化、抗炎等多种生物学活性，但尚未在SA-AKI模型中进行直接评估。因此，研究人员开展本研究，旨在探讨Rha是否通过调节铁死亡、炎症和NF-κB信号通路发挥肾脏保护作用，并阐明其可能的分子机制。该研究成果发表于《Journal of Biochemical and Molecular Toxicology》。

研究人员采用了体外和体内两种互补模型。体外实验使用人肾近端小管上皮HK-2细胞系，以脂多糖（LPS）刺激建立脓毒症相关损伤模型；体内实验采用雄性C57BL/6J小鼠，通过盲肠结扎穿刺（CLP）诱导SA-AKI模型。主要技术方法包括：CCK-8法检测细胞活力；铁离子检测试剂盒测定细胞内Fe²⁺水平；DCFH-DA荧光探针检测活性氧（ROS）；BODIPY-C11流式细胞术检测脂质ROS；硫代巴比妥酸法测定丙二醛（MDA）；ELISA检测炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α及肾损伤标志物NGAL、KIM-1；Western blot检测GPX₄、xCT、NF-κB信号通路蛋白表达；免疫荧光染色观察p65核转位；H&E染色评估肾组织病理；生化法检测血清肌酐（Scr）和尿素氮（BUN）。此外，使用erastin和ferrostatin-1（Fer-1）进行铁死亡干预，使用RANKL激活NF-κB信号以验证通路特异性。HK-2细胞来源于ATCC，小鼠由武汉第一医院实验动物中心提供。

研究结果分为五个部分。第一部分显示，Rha在5–40 μM浓度范围内不影响HK-2细胞基础活力，80 μM时仅轻微下降。在LPS处理细胞中，20和40 μM Rha显著提高细胞活力，降低细胞内Fe²⁺、ROS、MDA和脂质ROS水平，并上调GPX₄和xCT蛋白表达。Rha还能抑制erastin诱导的Fe²⁺积累，而Fer-1则降低Fe²⁺和ROS并增加GPX₄/xCT表达，提示Rha具有抑制铁死亡的作用。第二部分显示，Rha以剂量依赖方式降低LPS诱导的IL-1β、IL-6和TNF-α分泌。第三部分显示，Rha降低p-NF-κB/NF-κB和p-IκBα/IκBα比值，减少NF-κB p65核转位；RANKL作为一种NF-κB激活剂，可部分逆转Rha对p65核定位、细胞活力、Fe²⁺积累、ROS产生及炎症因子水平的影响，表明NF-κB信号通路是Rha作用的关键下游介质之一。第四部分显示，在CLP小鼠模型中，Rha（25和50 mg/kg）显著降低血清NGAL、KIM-1、Scr和BUN水平，减轻肾小管扩张、上皮肿胀和管腔碎片等组织病理改变，其中50 mg/kg组肾损伤评分显著下降。第五部分显示，Rha降低CLP小鼠肾组织Fe