Sclareol 抑制细胞生长并通过激活 p53/p21 信号通路诱导人口腔鳞状细胞癌细胞凋亡

《Journal of Biochemical and Molecular Toxicology》：Sclareol Inhibit Cell Growth and Induces Apoptosis via Activation of p53/p21 Signaling Pathways in Human Oral Squamous Cell Carcinoma Cells

　　

口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma, OSCC）是世界上最常见的癌症类型之一。在本研究中，研究人员探索了Sclareol对人口腔癌KB细胞的化疗效应，并科学地发现了细胞和分子水平的改变。研究人员将人口腔癌KB细胞和非洲绿猴肾正常细胞系（Vero）分别经不同浓度Sclareol（5–50 μM）和顺铂（0–10 μM）处理24 h后，进行了多种类型的检测。此外，研究人员通过MTT试验证明Sclareol诱导细胞毒性效应，通过DCFH-DA染色法检测活性氧（reactive oxygen species, ROS）水平，通过Rho123染色法评估线粒体膜电位（Δψ_m）的丧失，并通过DAPI及AO/EtBr染色检测KB细胞中的核浓缩和凋亡形态学变化。Sclareol通过氧化还原状态失衡促进氧化应激，并增加人口腔癌KB细胞的DNA损伤。此外，Sclareol通过激活p21waf1/cip1依赖性途径诱导凋亡，从而下调Rb（Ser780）、细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）和细胞周期蛋白E（Cyclin-E）的磷酸化水平。进一步地，该过程与线粒体介导的凋亡和促凋亡标志物相关，证据是Bcl-2蛋白下调以及Bax、细胞色素C（Cytochrome C）、Cleaved PARP、Cleaved Caspase及Caspase-9和Caspase-3上调，通过p53非依赖性途径诱导凋亡信号。因此，本研究结果表明Sclareol可能成为一种有效的新型化疗药物，用于对抗口腔鳞状细胞癌。

口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma, OSCC）是全球最常见的癌症之一，在发展中国家发病率居第六位。2020年GLOBOCAN估计全球新发癌症1930万例，死亡1000万例，预计到2040年印度癌症病例将增加57.5%。烟草、酒精、槟榔、吸烟及人乳头瘤病毒（human papillomavirus, HPV）感染是主要风险因素。癌症的核心标志包括无限增殖和逃避凋亡。p53作为关键肿瘤抑制因子，通过诱导p21（细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂）调节细胞周期和凋亡。天然产物因其低毒、经济而受到关注。Sclareol（Labd-14-ene-8,13-diol）是一种来源于鼠尾草属植物Salvia sclarea的二萜类活性成分，具有抗炎、抗氧化、抗癌等活性，但其对OSCC的作用及机制尚不明确。为此，研究人员开展了本研究，探讨Sclareol对人口腔癌KB细胞系的抗癌效应及分子机制。研究发表在《Journal of Biochemical and Molecular Toxicology》。

研究人员采用人口腔癌KB细胞和非洲绿猴肾正常Vero细胞作为模型。通过MTT法检测细胞活力，确定Sclareol的半数抑制浓度（half maximal inhibitory concentration, IC₅₀）为20 μM，顺铂为3 μM；Vero细胞在50 μM Sclareol处理下毒性较低。后续实验选用5、10、20 μM Sclareol及3 μM顺铂处理24小时。主要技术方法包括：MTT比色法评估细胞毒性；DCFH-DA荧光探针检测活性氧（ROS）；Rhodamine 123染色检测线粒体膜电位（Δψ_m）；AO/EtBr双染和DAPI染色观察凋亡形态；碱性彗星实验（alkaline comet assay）评估DNA损伤；Western blot检测凋亡相关蛋白表达。所有细胞系来源于印度国家细胞科学中心（National Centre for Cell Science, NCCS），浦那。

本研究的结果分为以下部分：

3.1 细胞毒性效应：MTT实验显示，Sclareol和顺铂剂量依赖性地降低KB细胞活力，而正常Vero细胞在Sclareol浓度高达50 μM时仍保持较高存活率，表明Sclareol对癌细胞具有选择性毒性。

3.2 Sclareol促进KB细胞ROS产生：DCFH-DA染色荧光强度和图像显示，Sclareol处理显著增加细胞内ROS水平，且呈浓度依赖性，提示氧化应激参与其细胞毒作用。

3.3 Sclareol改变线粒体膜电位：Rhodamine 123染色显示，Sclareol处理导致荧光强度下降，表明线粒体膜电位丧失（Δψ_m下降），提示线粒体功能障碍和早期凋亡。

3.4 Sclareol诱导KB细胞凋亡：AO/EtBr双染结果显示，Sclareol处理的细胞呈现典型凋亡形态（染色质浓缩、核碎裂），凋亡细胞百分比显著升高。

3.5 DAPI染色检测核浓缩：DAPI染色进一步证实Sclareol引起核浓缩、膜出泡和核碎片，增加凋亡细胞比例。

3.6 碱性彗星实验检测DNA损伤：彗星实验显示，Sclareol处理显著增加尾部DNA（% tail DNA）、尾长、尾矩和Olive尾矩等参数，表明诱导DNA单链/双链断裂。

3.7 Sclareol促进促凋亡蛋白并抑制抗凋亡蛋白：Western blot分析显示，Sclareol上调p53、Bax、细胞色素C、cleaved PARP、cleaved Caspase-3、Caspase-9和Caspase-3，同时下调Bcl-2，表明通过线粒体介导的内源性凋亡途径发挥作用。

3.8 Sclareol通过p21抑制细胞周期蛋白：Western blot显示，Sclareol上调p21^Waf1/Cip1，下调磷酸化Rb（Ser780）、Cyclin D1和Cyclin E，说明通过激活p21依赖的信号通路抑制细胞周期进展，从而阻止细胞增殖。

讨论部分指出，Sclareol通过增加ROS导致DNA损伤和线粒体膜电位丧失，进而激活Caspase级联反应。同时，Sclareol通过p53非依赖和p21依赖/非依赖途径调控凋亡。Bax/Bcl-2比率升高和细胞色素C释放进一步支持线粒体途径的参与。研究人员认为，Sclareol通过p53/p21信号通路抑制细胞生长并诱导凋亡，可能成为治疗口腔鳞状细胞癌的新型化疗药物。

结论部分翻译如下：总之，本研究提示Sclareol通过激活p53/p21信号通路抑制KB细胞生长并诱导凋亡。结果提供了Sclareol对人口腔癌细胞显著细胞毒作用的强有力实验证据。此外，细胞毒作用通过破坏ROS生成和改变线粒体膜电位的氧化还原稳态介导，从而引发凋亡。进一步地，Sclareol通过增强线粒体释放Bax和细胞色素C，促进Caspase-9和Caspase-3活化，并通过线粒体介导的内源性凋亡机制下调Rb、Cyclin D1和Cyclin E。更重要的是，Sclareol还通过p21/p53独立和依赖途径阻止细胞生长，从而诱导凋亡信号。本研究提出Sclareol具有抗癌特性，可能作为治疗口腔癌的新型抗癌药物。