Lantern的定向进化实现快速RNA和蛋白质邻近标记

《Nature Chemical Biology》：Directed evolution of Lantern enables rapid RNA and protein proximity labeling

　　

在真核细胞中，RNAs和蛋白质的精确空间定位对细胞正常功能至关重要。遗传编码光催化邻近标记技术拓展了原位绘制亚细胞蛋白质组与转录组的能力，但其时间分辨率仍受限。研究人员引入Lantern，一种通过定向进化优化的黄素蛋白（flavoprotein），可实现亚分钟级、空间分辨的生物分子标记。Lantern可靶向内质网（ER）、线粒体（mitochondria）和应力颗粒（SGs）等多种亚细胞区室，用于绘制局部转录组（CAP-seq）与蛋白质组（CAP-MS）。利用Lantern，研究人员观察到N6-甲基腺苷（m6A）富集RNAs在应激诱导10分钟内被招募至SGs，且ER近端RNAs在早期SG组装中与G3BP1相关。此外，Lantern被改造用于细胞表面标记（CAP-CELL），实现空间分辨细胞分型并识别细胞-细胞互作。该研究确立Lantern为一种高时间分辨率的强大工具，用于研究亚细胞分子网络的动态组织。

研究背景方面，真核细胞通过区室化保障RNAs与蛋白质精确定位，信号传导、病毒感染、细胞周期调控均依赖分子快速重分布。现有邻近标记方法中，生物素连接酶如BioID、TurboID可共价标记邻近蛋白质，但对RNA标记效率有限且缺乏精确时间控制；工程过氧化物酶如APEX2、HRP通过短寿命自由基在数十纳米内标记蛋白质和RNA，时间分辨率改善但仍受限于酶反应时长；光催化策略如miniSOG在蓝光下产生活性氧（ROS）实现CAP-seq与蛋白质标记，但需较长时间光照，难以捕捉应力颗粒组装等快速过程；LITag虽达秒级却需高光强且RNA全景标记表现不明。因此，亟需遗传编码、高活性、亚分钟级、低背景的邻近标记工具。

研究人员通过对miniSOG进行哺乳动物细胞内定向进化，获得三重突变体Lantern（S3G/W80N/Q102A），其单线态氧量子产率0.42、光稳定性增强、吸收峰440 nm，在30 mW cm^?2下1分钟或在450 mW cm^?2下1秒即可高效标记RNA与蛋白质，并适配ER膜、线粒体基质、P-body、细胞核、胞质等区室。

关键技术方法上，研究人员构建基于MS2-MCP的哺乳动物细胞定向进化平台，以自身转录本递归富集高光催化活性突变体；采用稳定细胞系（HEK293T、U-2 OS、原代大鼠皮质神经元rCNs、小鼠MC38癌细胞）开展空间转录组与时间序列分析；以TMT定量蛋白质组学分析SG蛋白质动力学；以数字微镜装置（DMD）选择性光照结合流式分选实现空间细胞标记与互作捕获。

研究结果中，Directed evolution of Lantern in mammalian cells部分显示，位点饱和突变筛选获得Lantern，其RNA标记优于SOPP2、SOPP3，蛋白质标记优于miniSOG，单线态氧传感绿（SOSG）氧化曲线证实活性提升，亚细胞定位成像验证多区室靶向能力。Spatially resolved transcriptome labeling by Lantern部分显示，ERM-Lantern的CAP-seq在1分钟即媲美miniSOG 15分钟结果，鉴定1382个ER近端RNAs且分泌途径特异性96.4%；1秒协议获1878个mRNAs、特异性97.3%；LITag同条件几乎无富集，证明Lantern高灵敏高特异。Mapping the SG transcriptome during assembly部分显示，G3BP1-Lantern在砷酸盐应激0—60分钟时间序列中定义3287个转录本并分六簇，m⁶A富集RNAs在10分钟即向SG招募，ERM RNAs早期与G3BP1关联，OMM RNAs无此现象，免疫荧光见早期SG小体与ER小管靠近，说明ER参与早期SG生物发生。Profiling SG proteome dynamics by CAP-MS部分显示，3-乙炔基苯胺（3-EA）探针配合150 mW cm^?2 30秒标记，TMT-CAP-MS在60分钟鉴定87个富集蛋白中97.7%为SG组分，83/87在15分钟内检出，m⁶A读取蛋白如IGF2BP1约10分钟后上升，时间顺序为m⁶A RNA最早、随后m⁶A读取蛋白与eIF2α磷酸化、SG体积迟发，表明RNA招募先于蛋白质聚集。Lantern profiles SG transcriptomes in neurons部分显示，rCNs中用Lantern 1分钟标记背景低，鉴定1268个SG转录本，与HEK293T共有113个、神经元特有178个，smFISH验证Atp5f1a、Elp2、Wdr6富集于SG，Tet3、Ybx1耗竭，揭示细胞类型特异性SG转录组。Spatially resolved cellular tagging with Lantern部分显示，Lantern-TM定位于膜，DMD光照分选mCherry/mTurquoise群体准确率超80%；MC38创缘近侧细胞富集Actb、Fbln2、Tubb5等迁移相关基因；CD40L-Lantern与CD40共培养中trans标记可达28.6倍，证明接触依赖性细胞-细胞互作可绘图。

讨论部分总结中，研究人员指出微生物系统演化变体在哺乳细胞质常失效，故建立哺乳动物细胞内RNA自标记选择平台，可拓展至其他RNA修饰酶工程化。Lantern在效率与时间分辨率上优于miniSOG、APEX2、TurboID及外源小分子光催化方案。SG组装中长RNA与高m⁶A修饰富集，应激非依赖互作子具长编码序列低m⁶A，反映G3BP1纳米域组织；ERM转录本应激依赖关联G3BP1，支持ER在SG发生中的作用。

结论部分翻译：在本研究中，研究人员通过定向进化构建了遗传编码光催化剂Lantern。既往理性设计获单线态氧产率改善的miniSOG变体，但miniSOG大规模筛选尤指RNA标记尚未报道。研究人员以哺乳动物细胞选择平台将胞内RNA标记转为定量选择读数，使光催化活性与编码序列关联。该RNA自标记策略原则上可扩展至其他RNA修饰酶工程。Lantern在标记效率与时间分辨率上超越现有邻近标记，1秒级动力学的遗传编码标记优于APEX2 1分钟、TurboID超10分钟；外源Halo-seq、HaloMap、μMap-seq需洗涤去未结合催化剂而增加背景。利用Lantern描绘SG组装发现SG转录组富集长RNA与高m⁶A，应激非依赖互作子具长编码序列低m⁶A并存于成熟SG核心。研究人员进一步观察ER膜转录本应激依赖关联G3BP1，与未折叠蛋白响应中ER定位转录本入胞质颗粒一致。该研究论文发表于《Nature Chemical Biology》。