carABpyrB操纵子的表征及pyrE在新凶手弗朗西斯菌生物被膜形成中的作用

《MicrobiologyOpen》：Characterization of carABpyrB operon and role of pyrE in Francisella novicida biofilm

　　

嘧啶生物合成（pyrimidine biosynthesis）对细菌生长至关重要，但其在调控新凶手弗朗西斯菌（F. novicida）生物被膜形成中的作用仍知之甚少。在本研究中，研究人员实验性定义了F. novicida中的carABpyrB操纵子，并研究了从头嘧啶生物合成途径的破坏如何在营养限制条件下影响生长和生物被膜形成。逆转录PCR（RT-PCR）证实了carA、carB和pyrB的共转录，启动子预测鉴定出carA上游两个推定σ⁷⁰依赖性启动子区域。在carA、carB和pyrB中插入转座子破坏的突变体在Chamberlain限定培养基（CDM）中表现出显著生长缺陷，而尿嘧啶补充可恢复该缺陷，证实了嘧啶营养缺陷型及从头嘧啶生物合成的功能性破坏。随后，研究人员将该分析扩展到嘧啶生物合成途径中的其他基因，并在改良Mueller–Hinton肉汤（MMHB，一种营养限制条件）中评估了生物被膜形成。在该培养基中，carA、carB、pyrB和pyrE突变体表现出生长缺陷；然而，pyrE突变体独特地产生了显著多于野生型的生物被膜。即使在未进行生长归一化的情况下，该表型仍然明显，pyrE突变体产生的生物被膜是野生型的3.3倍（尽管生长受损），而归一化到生长后增至11.8倍。定量PCR（qPCR）表明，尿嘧啶补充可抑制carA、carB和pyrB的转录，与该途径的反馈调节一致。总之，这些发现表明，嘧啶限制不仅仅是生长限制条件，还可改变生物被膜调控，其中pyrE的破坏揭示了从头嘧啶生物合成与生物被膜形成之间的强关联。

论文解读

《MicrobiologyOpen》近期发表了一项关于新凶手弗朗西斯菌（Francisella novicida）嘧啶代谢与生物被膜调控的研究。嘧啶生物合成对细菌生长不可或缺，但在F. novicida中其对生物被膜形成（biofilm，细菌附着表面形成的多细胞群落）的调控作用尚不明确。此前，Qin和Mann曾在F. tularensis Schu S4中推测carAB操纵子可能包含pyrB，但该操纵子在F. novicida中未被正式实验定义。同时，从头嘧啶合成途径（de novo pyrimidine biosynthesis，利用小分子前体合成嘧啶核苷酸的途径）在营养限制条件下中断如何影响生长和生物被膜，也缺乏系统研究。因此，本研究旨在实验验证carABpyrB操纵子的结构，并探讨该途径在营养限制条件下对F. novicida生物被膜形成的调控作用。

研究人员利用逆转录PCR（RT-PCR）证实了carA、carB和pyrB的共转录，通过启动子预测软件鉴定了carA上游的σ⁷⁰启动子区域。他们使用来自BEI Resources的F. novicida双等位基因转座子突变文库（Gallagher等构建），选取carA、carB、pyrB以及pyrC、pyrD、pyrE、pyrF和lpxH等突变体，在Chamberlain限定培养基（CDM）和改良Mueller–Hinton肉汤（MMHB）中测定生长曲线，采用结晶紫染色定量生物被膜，并利用定量PCR（qPCR）分析尿嘧啶对基因转录的影响。关键的技术方法包括：RT-PCR operon验证、BPROM启动子预测、CDM和MMHB中的生长及尿嘧啶回补实验、96孔板结晶紫生物被膜定量，以及qPCR基因表达分析。样本来源为BEI Resources提供的转座子突变文库。

研究结果分述如下：

3.1 carABpyrB操纵子在F. novicida中的实验证明：通过RT-PCR扩增跨基因间隔区，确认carA–carB和carB–pyrB之间存在共转录产物，而FTN_0022–carA和pyrB–sdaC之间无产物，从而证明carA、carB、pyrB组成一个操纵子。

3.2 carABpyrB操纵子启动子元件的计算机预测：BPROM在carA上游预测到两个σ⁷⁰启动子，远端高置信度位点P1和近端低置信度位点P2，其?35/?10盒间距分别为17 bp和16 bp。该预测与F. tularensis LVS中实验确定的σ⁷⁰结合位点位置相符。

3.3 carA、carB和pyrB突变体的生长缺陷可被尿嘧啶补充恢复：在CDM中，除两个疑似脱靶突变体外，其余carA、carB和pyrB转座子突变体均表现出完全生长抑制或明显延迟。添加50 μg/mL尿嘧啶可恢复其生长，而精氨酸不能恢复，证实这些基因的功能缺陷来自嘧啶生物合成途径。

3.4 MMHB中生物被膜分析揭示嘧啶合成基因的调控作用：在MMHB中，carA2、carB2、pyrB2和pyrE突变体生长显著受抑；但pyrE突变体产生显著增多的生物被膜，未归一化时达野生型的3.3倍，归一化到生长后达11.8倍。补充尿嘧啶可恢复其生长并使生物被膜回到基线。阴性对照qseC突变体则显示生物被膜显著减少。

3.5 尿嘧啶补充调节carABpyrB操纵子的转录：qPCR结果显示，在CDM中添加12.5 μg/mL尿嘧啶可使pyrB、carB和carA转录水平分别下降约2.2倍、1.5倍和6.5倍，表明该操纵子受嘧啶的反馈抑制。

3.6 pyrE突变体中可能的极性效应：qPCR分析发现，pyrE转座子插入导致插入位点上游转录增加、下游转录显著降低至约0.25倍，并使下游lpxH基因表达降至约0.4倍，提示存在极性效应。但lpxH突变体未产生类似的生物被膜增加表型，且尿嘧啶可大部分恢复pyrE的生物被膜表型，说明该表型主要源于嘧啶途径破坏。

3.7 不同培养基对F. novicida及carABpyrB突变体的影响：突变体在CDM和MMHB中表现出明显的尿嘧啶营养缺陷和生物被膜比值升高，而在富培养基TSB-C中表型较轻，表明培养基中可补救的嘧啶可部分补偿从头合成缺失。

讨论部分总结了以下要点：从头嘧啶合成与补救途径（salvage pathway，利用外源碱基或核苷合成核苷酸的途径）在不同生长阶段存在交替——在富含营养的对数期，补救途径占主导；当营养消耗进入稳定期或处于最小培养基时，网络转向依赖从头合成。pyrE在途径中位置靠后，其失活导致UMP合成受限，可能形成区别于早期途径缺失的代谢状态，从而促进生物被膜上调。信号分子如c-di-GMP和(p)ppGpp可能参与这一调控网络，但具体的分子机制仍需进一步研究。该研究首次揭示了pyrE在F. novicida生物被膜调控中的角色，将嘧啶限制鉴定为生物被膜形成的关键代谢线索。

研究结论翻译：总之，本研究通过证实carABpyrB操纵子包含三个基因，增进了对Francisella中该操纵子结构和功能的理解。数据表明，嘧啶生物合成可能对F. novicida生长具有正调控功能，对生物被膜形成具有负调控功能，暗示核苷酸代谢与环境适应之间存在潜在联系。这些见解可能有助于通过靶向生物被膜相关途径制定控制Francisella在环境中持续存在的策略。最终，本工作揭示了从头嘧啶生物合成作为响应性代谢控制点，可在营养限制下使细菌在生长和生物被膜状态之间转换，从而加深了对Francisella环境生存的理解。