单管RPA-CRISPR/Cas12a可视化检测方法用于猴痘病毒Clade I的超特异性检测

《Microbial Biotechnology》：One-Pot RPA-CRISPR/Cas12a Assay With Visual Readout for the Ultra-Specific Detection of Monkeypox Virus Clade I

　　

2024年，猴痘病毒（Monkeypox virus，MPXV）Clade I已在全球多个国家引发疫情。MPXV Clade I表现出增强的毒力和传播能力，病死率达10%。为此，研究人员开发了一种特异性靶向MPXV Clade I的单管检测方法，该方法结合了重组酶聚合酶扩增（recombinase polymerase amplification，RPA）和CRISPR/Cas12a系统。该检测可在40分钟内完成，95%检测限（LOD₉₅）为27.16拷贝/μL。未观察到与MPXV Clade II或其他测试病毒模板（包括痘苗病毒（Vaccinia virus，天坛株））的交叉反应。初步的室温评估显示，该检测在25°C下仍保持可检测性能，支持其在设备受限环境中的潜在应用。该检测对重组质粒模板也表现出良好的批内和批间重复性，所有变异系数（coefficient of variation，CV）值均低于10%。在模拟临床样本中，RPA-CRISPR/Cas12a检测比定量聚合酶链反应（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）检测到更多低浓度质粒加标样本。这些结果表明，所建立的检测方法特异、灵敏、可重复且易于操作，为MPXV Clade I的现场筛查和分散化检测提供了实用工具。

论文解读：单管RPA-CRISPR/Cas12a可视化检测猴痘病毒Clade I

猴痘病毒（MPXV）Clade I在2024年引发全球多国疫情，其毒力与传播力显著强于Clade II，病死率可达10%，且儿童感染与死亡比例极高。目前广泛使用的聚合酶链反应（PCR）虽为世界卫生组织推荐的检测方法，但存在耗时长、依赖昂贵热循环仪等局限，难以满足现场快速筛查和资源匮乏场景的需求。因此，亟需开发一种针对MPXV Clade I的快速、特异且易于操作的新型检测方法。

针对这一需求，研究人员将重组酶聚合酶扩增（RPA）与CRISPR/Cas12a系统整合，建立了一种单管可视化检测方法。该方法可在40分钟内完成，95%检测限（LOD₉₅）为27.16 copies/μL，与MPXV Clade II及多种近源病毒无交叉反应，在25℃室温下仍保持检测能力。在模拟临床样本中，其低浓度样本检出率优于定量PCR（qPCR）。该研究为MPXV Clade I的现场筛查和分散化检测提供了实用工具，论文发表于《Microbial Biotechnology》。

在技术方法方面，研究人员主要采用了以下关键策略：从实验室构建的质粒表达并纯化LbCas12a蛋白，经SDS-PAGE和活性测定验证其纯度与反式切割活性；基于MPXV Clade I保守区设计并筛选crRNA和RPA引物；采用分室管套设计，将RPA反应混合液与CRISPR/Cas12a检测混合液物理分隔于同一离心管内，扩增后经离心合并，实现单管闭管操作，避免气溶胶污染；以ssDNA荧光报告分子为信号，利用蓝光透射仪或智能手机拍照，并通过ImageJ提取绿色通道像素值进行结果判读。模拟临床样本以Vero细胞和293T细胞DNA为背景，共制备32个加标样本，与qPCR进行平行比较。

研究结果如下。

**1. Cas12a蛋白制备与活性验证**：制备的Cas12a蛋白经薄层扫描确认纯度为96.98%，在既有CRISPR/Cas12a检测平台上呈强荧光信号，证实其具备高效反式切割活性。

**2. crRNA筛选**：比较两种针对靶序列的crRNA，发现crRNA-I-2产生的荧光信号强度显著高于crRNA-I-1，因此选择crRNA-I-2用于后续实验。

**3. CRISPR/Cas12a系统优化**：通过梯度滴定确定最优反应浓度：Cas12a蛋白187.5 nM、crRNA 25 nM、ssDNA报告分子1 μM，该组合提供了最强的荧光信号与反应效率。

**4. RPA引物筛选与扩增温度优化**：对三对候选RPA引物进行筛选，其中RPA-3-F/R引物对扩增效率最高，被选定用于后续实验。温度梯度测试表明，在39℃下扩增信号最强，且可检测低至4.37×10¹ copies/μL的重组质粒，因此确认39℃为最佳扩增温度。

**5. 分析灵敏度与特异性**：初步灵敏度实验显示，在优化条件下可检出4.37×10¹ copies/μL。进一步选取五个浓度（43.70、21.85、10.93、5.46、2.73 copies/μL）各进行20次重复，结果显示43.70 copies/μL时20/20阳性，21.85 copies/μL时15/20阳性，10.93 copies/μL时6/20阳性，更低浓度全部阴性。通过概率回归分析得出LOD₉₅为27.16 copies/μL（95%置信区间23.06–35.24）。室温（25℃）条件下，可稳定检出4.37×10² copies/μL。特异性评价中，仅MPXV Clade I重组质粒产生明显荧光，与MPXV Clade II、痘苗病毒（VVT，天坛株）、牛痘病毒（CPXV）、水痘-带状疱疹病毒（VZV）及猴B病毒（BV）均无交叉反应。

**6. 批内与批间重复性**：使用四种浓度（4.37×10³至4.37×10⁰ copies/μL）的重