《Molecular Ecology》：A Cis-Regulatory Duplication in a Hox Hotspot Implicated in Mimetic Convergence in the Bumble Bee Bombus flavifrons
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北美多种熊蜂跨越太平洋沿岸和落基山地区域，通过将腹部颜色从黑色转变为红色，趋同于每个区域不同的拟态腹部颜色形态。先前对两种拟态物种（*Bombus melanopygus* 和 *Bombus vancouverensis*）红黑转变的全基因组关联研究（GWA
北美多种熊蜂跨越太平洋沿岸和落基山地区域，通过将腹部颜色从黑色转变为红色，趋同于每个区域不同的拟态腹部颜色形态。先前对两种拟态物种（*Bombus melanopygus* 和 *Bombus vancouverensis*）红黑转变的全基因组关联研究（GWAS）揭示，黑色形态是通过独立缺失 *Hox* 基因 *Abdominal-B*（*Abd-B*）附近同一顺式调控区的一部分产生的。本研究检验了第三种共拟态物种 *Bombus flavifrons* 中这些拟态颜色形态的遗传基础，该物种的红黑变异是连续的，并且与其共拟态物种相比，颜色区域向后移动了一个体节。通过对红色和黑色形态进行全基因组关联分析，研究人员鉴定出一个距离 *B. melanopygus* 和 *B. vancouverensis* 缺失位点不到 50 bp 的结构变异，该变异与颜色表型强烈相关。对拟态地带和近缘分类群的测序揭示，*B. flavifrons* 的所有红色形态和单态红色的近缘种 *Bombus centralis* 在该位点均有一个 319 bp 的串联重复，且重复拷贝经历了广泛修饰。来自喀斯喀特山脉的黑色形态 *B. flavifrons* 也具有该重复，但没有这些修饰，而落基山脉西部的黑色形态大多缺乏该重复，类似于祖先黑色形态。这表明不同种群中黑色表型可能由独立机制调控，并且祖先变异的分选和/或适应性渐渗产生了这些表型。本研究加强了对 *Abd-B* 顺式调控区作为熊蜂腹部颜色调控热点的支持，并突出了调控区重复在创造新表型中的作用。
**论文解读：顺式调控重复驱动熊蜂 *Bombus flavifrons* 的拟态颜色趋同**
**1. 研究背景与科学问题**
在进化遗传学中，相似性状在多个独立谱系中的重复出现为预测基因、基因区域及发育通路组分的进化靶标提供了天然重复样本。颜色多态性由于表型直观、受强选择作用，是研究趋同进化的有力体系。熊蜂（*Bombus*）因 Müllerian 拟态产生了丰富的体色多样性，其警戒色作为共享警告信号，驱动了至少24个地理颜色复合群的形成。在北美西部，太平洋沿岸与落基山地区域分别以黑色和红色中腹为特征的拟态复合群，约有7种熊蜂跨越两区域并发生相应的腹部颜色转变。此前全基因组关联研究在 *Bombus melanopygus* 与 *Bombus vancouverensis* 中定位到相同的 *Hox* 基因 *Abdominal-B*（*Abd-B*）顺式调控区，两种物种分别通过独立的75 bp和7 bp缺失产生黑色形态。然而，第三种共拟态物种 *Bombus flavifrons* 的红黑变异为连续过渡，且着色体节比共拟态物种后移一个体节，其遗传机制尚不清楚。本研究旨在鉴定 *B. flavifrons* 颜色多态性的遗传基础，比较其与已研究物种的异同，并探讨调控区重复在表型创新中的作用。
**2. 关键技术与方法**
研究人员对76只雄性单倍体 *B. flavifrons*（35只黑色形态、41只红色形态）进行全基因组短读长测序，覆盖喀斯喀特山脉黑色种群、东部红色种群及东北俄勒冈过渡区。使用GATK进行变异检测，分别采用包含和不包含喀斯喀特样本的数据集进行基于SNP的GWAS（Fisher精确检验及校正群体结构的REGENIE），并实施k-mer GWAS以捕获结构变异。通过PCR和Sanger测序验证串联重复的存在及单倍型序列。对雌性二倍体工蜂进行全基因组测序以构建物种树（SplitsTree、SNAPPER），并运用Dsuite进行渐渗检验（ABBA-BABA、f4-ratio）。转录因子结合位点（TFBS）预测使用JASPAR数据库。
**3. 研究结果**
**3.1 采样与群体结构**
基于全基因组SNP的主成分分析（PCA）显示，喀斯喀特黑色样本构成独立遗传簇，与东部种群明显分化。去除喀斯喀特样本后，东部红黑形态大体混合，但存在沿地理梯度（犹他至俄勒冈）的遗传关系以及与颜色的部分关联。
**3.2 基于基因组关联的位点鉴定**
标准SNP关联分析未通过严格显著阈值，但去除喀斯喀特样本后，一个SNP超过软阈值，定位到已知的 *Abd-B* 顺式调控区。手动检查IGV发现红色形态覆盖度均匀，黑色形态在邻近区域覆盖度极低，进而鉴定出一个319 bp串联重复：所有41只红色个体均携带该插入，喀斯喀特黑色个体也携带，但东部18/25黑色个体缺失。
**3.3 结构变异分析**
k-mer GWAS独立定位到相同的 *Abd-B* 区域，并在包含及排除喀斯喀特样本的数据集中均达显著水平。显著k-mer全部比对至重复区域，效应大小及等位基因频率一致，代表单一结构变异。未发现其他显著关联位点，核心黑色素基因附近亦无关联峰。连锁不平衡分析表明该区域重组率高，仅重复区域内部存在高连锁。
**3.4 插入特征鉴定**
PCR和Sanger测序确认串联重复长度为319–321 bp，两拷贝间有7 bp独特间隔序列。所有红色雄蜂（41/41）均含重复，东部黑色雄蜂中14/66含重复，喀斯喀特黑色雄蜂全部含重复。重复序列存在多种单倍型，红色形态的重复拷贝衍生程度高，喀斯喀特黑色形态的重复拷贝更接近祖先序列。二倍体工蜂中，不含重复的纯合子为黑色，含一个东部重复的单拷贝杂合子呈黑色或中间色，含两个东部重复的纯合子为红色。
**3.5 插入进化**
基于全基因组数据的物种树显示 *B. centralis*（红色）与 *B. vandykei*（黑色）为姐妹群，二者共同与 *B. flavifrons* 在大约230万年前分化。但在颜色位点，*B. centralis* 固定携带与东部红色 *B. flavifrons* 高度相似的插入，而黑色近缘种（*B. caliginosus*、*B. vandykei*、*B. vagans*）均无此重复。重复单倍型网络显示喀斯喀特单倍型处于中心位置，提示其为原始重复来源；*B. centralis* 的重复单倍型与 *B. flavifrons* 的衍生单倍型相近。ABBA-BABA检验检测到 *B. centralis* 与两个 *B. flavifrons* 种群间以及 *B. vandykei* 与喀斯喀特种群间存在显著的额外等位基因共享，但颜色位点附近的渐渗信号并不强于全基因组背景。
**3.6 转录因子结合位点及富集分析**
TFBS预测显示，含重复的单倍型平均包含273个预测结合位点，而不含重复的单倍型仅有134个，重复使结合位点数量增加一倍以上。新增基序包括 *shavenbaby* 和 *paired*，其中 *shavenbaby* 控制刚毛发育。*araucan* 结合位点在红色形态中显著增加，且在黑色或中间表型相关单倍型中减少。喀斯喀特黑色单倍型的结合位点数量与东部含重复单倍型相近，而非与不含重复的黑色单倍型相近。富集分析表明重复相关单倍型富集于肌肉细胞命运决定、赤道特化和生长负调控等功能。
**4. 讨论与结论**
本研究证实 *B. flavifrons* 与共拟态物种 *B. melanopygus*、*B. vancouverensis* 靶向相同的 *Abd-B* 顺式调控区，但通过独立的突变事件实现趋同表型：前两者用缺失产生黑色，而 *B. flavifrons* 用串联重复产生红色。这进一步支持该区域是熊蜂腹部颜色进化的基因组热点。重复的产生可能在保留祖先调控功能的同时，为第二个拷贝积累新突变和转录因子结合位点提供了空间，从而产生新调控机制。不同种群（喀斯喀特与东部）的黑色形态在重复状态和序列上存在差异，提示可能存在独立机制或祖先变异分选。群体基因组分析表明，*B. centralis* 与 *B. flavifrons* 共享的衍生重复单倍型可能源于不完全谱系分选或历史渐渗。研究还揭示短读长测序在检测中等长度结构变异上的局限性，而k-mer GWAS可作为有效补充。受限于 *B. flavifrons* 难以实验室饲养，目前无法开展基因表达或功能验证，未来需要长读长测序及功能遗传学手段进一步阐明该调控区的精确作用机制。
**研究结论**：本研究表明，*B. flavifrons* 的红黑拟态颜色由 *Abd-B* 顺式调控区的一个319 bp串联重复（伴随7 bp插入）所驱动，该重复通过改变转录因子结合位点数量来调控 *Abd-B* 表达，从而产生红色表型。不同地理种群的黑色形态可能通过不同遗传机制形成，而重复单倍型在近缘种间的分布提示祖先变异分选和/或渐渗参与了表型的演化。该发现强化了 *Abd-B* 顺式调控区作为熊蜂体色调控热点的地位，并强调了调控区重复在创造新表型中的重要作用。
