《Molecular Genetics & Genomic Medicine》：Clinical Application of Long-Read Sequencing for FMR1 Gene Mutation Detection in Populations From Shandong, China
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背景：脆性X综合征（Fragile X syndrome，FXS）是一种常见遗传性智力障碍。本研究采用长读长测序进行FMR1基因检测。方法：有家族遗传性智力障碍男性及有FXS筛查指征女性被定义为高风险人群，并与非高风险育龄女性一同纳入。非高风险育龄女性先用PC
背景：脆性X综合征（Fragile X syndrome，FXS）是一种常见遗传性智力障碍。本研究采用长读长测序进行FMR1基因检测。方法：有家族遗传性智力障碍男性及有FXS筛查指征女性被定义为高风险人群，并与非高风险育龄女性一同纳入。非高风险育龄女性先用PCR-毛细管电泳初筛，异常样本与高风险人群样本进行长读长测序；需者行长读长产前诊断。结果：高风险女性突变率3.10%（7/226）；男性样本检出3例突变，突变比约8.3%（3/36）；最常见CGG重复为29、30、36；242例样本分析获908个AGG中断，涉67种模式，最常见为(CGG)9AGG(CGG)9AGG(CGG)9；长读长测序成功用于2名孕妇产前诊断并检出一家系CGG动态突变。结论：长读长测序法不仅能准确检测CGG重复与AGG中断，还可同时识别FMR1其他异常，检测范围更广、FXS相关遗传特征刻画更优。
研究背景：脆性X综合征（Fragile X syndrome，FXS）由FMR1基因（X连锁基因）5′非翻译区CGG重复扩展所致，99%病例为CGG异常扩展。现有美国医学遗传学与基因组学学会（American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）推荐方法各有局限：Southern blot分辨率低且需联合PCR；常规PCR难扩增多数全突变（full mutation，CGG>200）；三联体重复引物PCR（triplet repeat-primed PCR，TP-PCR）不能精确判读女性AGG中断、单核苷酸变异（single nucleotide variant，SNV）及缺失/插入。山东缺乏本地化FMR1突变数据，因此研究人员以长读长测序（long-read sequencing）开展人群检测与临床验证。该研究论文发表于《Molecular Genetics》。
主要技术方法与队列：研究人员采用PCR-毛细管电泳初筛非高风险育龄女性；异常者及高风险者行PacBio Sequel II平台环形一致性测序（circular consensus sequencing，CCS）长读长测序，序列比对hg38，核密度估计定峰，FreeBayes识别外显子1的SNV与小的插入缺失（insertion/deletion，InDel）。队列含226名高风险女性、36名家族遗传性智力障碍男性、2472名非高风险育龄女性，以及需产前诊断者的羊水样本。
研究结果
3.1 FMR1基因突变：经PCR-毛细管电泳与长读长测序分析，226名高风险女性中219正常、6名前突变（premutation，55–200 CGG）、1名嵌合全突变；2472名育龄女性中14名中间型（intermediate allele/gray zone，45–54 CGG）、3名前突变、无全突变；36名男性中3名嵌合全突变/大重复。结论为高风险男性突变率约8.3%，育龄女性以低危中间型/前突变为主。
3.2 FMR1 CGG重复分布：排除嵌合个体后，高风险女性450条X染色体共33种等位，最常见29（49.11%）、30（25.33%）、36（9.78）；育龄女性4944条X染色体共38种等位，29、30、36同样居前。结论为山东汉族育龄女性CGG谱与既往中国人群一致，36重复在亚洲人群高频。
3.3 FMR1基因AGG中断模式：242例（14男、228女）长读长测序识出908个AGG中断、67种模式；最常见9A9A9占43.62%，次为10A9A9占23.83%；470条等位中2、1、0个AGG中断分别占72.77%、14.04%、2.13%，4个AGG中断仅见于正常等位。结论为长读长测序可分离女性双X与嵌合等位，传统法难做女性AGG模式。
3.4 临床应用：PCR-毛细管电泳初筛后长读长测序确认异常；一例曾育全突变孤独症男婴的孕妇，羊水长读长示男胎(CGG)9(AGG)1(CGG)163/(CGG)9(AGG)1(CGG)350/(CGG)9(AGG)1(CGG)636全突变并终止妊娠；一例前突变孕妇羊水胎儿为(CGG)10(AGG)1(CGG)19并足月活产；还发现70 CGG无AGG中断前突变母亲传代扩至369/749，三代男童再扩至289/402/523。结论为长读长测序支撑生育指导、产前诊断与动态突变追踪。
讨论总结：研究人员指出亚洲人群正常CGG与侧翼单倍型多样性低于高加索与非裔；山东数据补区域空白。AGG中断可稳定CGG Tract，无AGG且CGG≥70易动态扩展，故AGG分析提升女性前突变咨询精度。前突变携带者有FXTAS、FXPOI与神经精神共病风险。长读长测序还能识exon 1微缺失、嵌合等位；但成人全突变仍需联合甲基化（methylation）检测。本研究建成山东首个FMR1本地数据库，克服通用库难容区域异质性之限。
结论翻译：长读长测序具有长读长、高精度、无GC偏向，已用于地中海贫血、先天性肾上腺增生、脊髓性肌萎缩检测；长片段超高GC PCR联合Oxford Nanopore亦可测FMR1且与TP-PCR/Southern blot一致。相比传统PCR，长读长测序不仅准测CGG重复与AGG中断，还同时识突变、缺失、嵌合；检测范围更广、FXS遗传特征刻画更好，成本与传统PCR相近。因平台少、普及低、周期长，群体筛查先PCR-毛细管电泳初筛再长读长验证；望技术普及后早用于大规模FXS人群筛查。
