《Molecular Plant Pathology》：Systematic Identification and Functional Characterisation of Colletotrichum fructicola Effectors During Camellia oleifera Colonisation
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油茶（Camellia oleifera）是中国南方重要的木本油料作物，但其生产受到Colletotrichum fructicola所致炭疽病的严重威胁。该病原菌通过分泌效应蛋白（effector proteins）建立侵染。然而，感染期间上调的C. fru
油茶（Camellia oleifera）是中国南方重要的木本油料作物，但其生产受到Colletotrichum fructicola所致炭疽病的严重威胁。该病原菌通过分泌效应蛋白（effector proteins）建立侵染。然而，感染期间上调的C. fructicola效应基因的系统鉴定与功能表征仍鲜有研究。研究人员整合全基因组分泌组预测与C. oleifera叶片接种C. fructicola后的RNA-seq数据，筛选感染诱导的候选效应蛋白，随后进行功能筛选、靶向基因缺失、互补与致病性测定。研究人员鉴定出5个对C. fructicola完全毒力必需的新型效应蛋白，均可抑制Nicotiana benthamiana中Bax诱导的细胞死亡（cell death）。在C. oleifera叶片上靶向缺失相应基因使病斑面积减少47%–78%，在苹果果实上减少最高达67%，而互补恢复至野生型（wild-type，WT）水平。感染后果实转录组显示差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs）富集于铜离子响应相关GO term，以及苯丙烷生物合成、牛磺酸与次牛磺酸代谢、植物–病原互作等KEGG通路。此外，与WT接种相比，效应蛋白缺失突变体接种的C. oleifera叶片中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）和过氧化物酶（peroxidase，POD）活性及丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量发生改变，表明这些效应蛋白可能参与调控宿主氧化应激响应。综上，研究从遗传与生理层面证明这些效应蛋白促进C. fructicola毒力，为炭疽病防控提供潜在靶标。
《Molecular Plant Pathology》发表的该研究聚焦油茶炭疽病优势病原Colletotrichum fructicola的分泌效应蛋白。油茶为中国特色木本油料作物，炭疽病在主要栽培区普遍发生，年减产10%–30%，严重年份超50%；已报道的Colletotrichum包括C. fructicola、C. siamense、C. gloeosporioides、C. camelliae与C. karstii，其中C. fructicola因分布广、致病强成为优势种。作为半活体营养病原（hemibiotrophic pathogen），其效应蛋白在油茶–病原互作中的功能长期缺乏系统解析，基因组水平效应蛋白鉴定与功能验证尤为有限，因此研究人员开展了全基因组分泌组联合感染转录组效应蛋白挖掘与功能研究。
关键技术方法上，研究人员以C. fructicola Nara gc5注释蛋白为对象，用SignalP、TMHMM、SecretomeP、TargetP、ScanProsite、PredGPI预测经典与非经典分泌蛋白；以CFLH16为功能菌株，取玻璃纸诱导侵染菌丝（cellophane-induced infectious hyphae，CIH）与接种72 hpi油茶感染叶（infected leaves，IL）做RNA-seq，用DESeq2筛DEGs；用Nicotiana benthamiana瞬时表达做Bax细胞死亡抑制 assay；构建候选效应基因缺失突变体与互补株；以油茶离体叶、苹果果实做致病测定；对感染油茶果实做宿主转录组并做GO/KEGG富集；测定叶片MDA与SOD、CAT、POD活性。样本来自中南林业科技大学果园5年生‘Hua Shuo’油茶及市售Gala苹果。
2.1 Germination of C. fructicola Conidia and Infection Progression on C. oleifera Leaves：通过离体玻璃纸与活体叶片观察，3 hpi萌发、12 hpi附着胞成熟、72 hpi可见细胞内活体营养菌丝，据此选12 hpi、36 hpi与72 hpi作为取样点。
2.2 Genome-Wide Identification of Candidate Effectors With High Expression During C. fructicola Infection：经分泌组过滤得2034个推定分泌蛋白；以IL TPM>100、CIH TPM<1且长度≤300 aa筛出77个高置信候选效应蛋白（CfCEs），取表达最高的20个无功能注释候选CfCE1–CfCE20。
2.3 Five Novel CfCEs Suppress Bax-Induced Cell Death：RT-qPCR验证17个候选表达趋势与RNA-seq一致；本氏烟中共表达Bax与CfCE1、CfCE2、CfCE12、CfCE13、CfCE20显著减弱Bax诱导细胞死亡，提示其具免疫抑制功能。
2.4 Five CfCE Effectors Are Required for Full Virulence on C. oleifera：油茶离体叶接种显示，5个基因缺失突变体病斑面积较WT下降50.0%–78.8%，互补株恢复WT水平，证明其为完全毒力必需。
2.5 Five CfCEs Contributes to the Virulence of C. fructicola on Apple：苹果果实接种中，ΔCfCE12突变体病斑减少约67.6%–68.3%，其余突变体也显著降低病斑，说明毒力功能跨寄主保守。
2.6 Transcriptomic Responses of C. oleifera Fruits Following C. fructicola Infection：采后油茶果感染转录组获3577个DEGs；GO富集于水解酶、铜离子响应、叶绿体RNA修饰等，KEGG富集于牛磺酸与次牛磺酸代谢、类胡萝卜素合成、植物–病原互作、苯丙烷生物合成等。
2.7 Candidate Effectors Modulate Host Oxidative Stress Responses During C. fructicola Infection of C. oleifera Leaves：与WT比，缺失突变体感染叶MDA更低；SOD早期偏高、后期多偏低；CAT全程降低；POD因效应蛋白不同而上调或下调，表明候选效应蛋白调控宿主氧化还原稳态。
讨论部分指出，该研究首次在Colletotrichum–C. oleifera体系做系统效应蛋白挖掘与功能分析；以参考基因组预测、CFLH16验证具可行性，但单时间点72 hpi可能漏掉阶段特异性效应蛋白；Bax死亡抑制与缺失表型提供直接遗传学证据；宿主转录组显示次生代谢、细胞壁、植物–病原互作通路被扰动；抗氧化酶变化更宜解释为效应介导免疫抑制解除后的下游生理结果，而非已证实的效应蛋白–酶直接互作；未来需多时点转录组与靶标鉴定。
结论部分译为：本研究呈现了首个与C. oleifera炭疽病相关的C. fructicola效应蛋白全基因组挖掘与功能表征。通过整合基于基因组的分泌预测与感染期C. fructicola转录组数据，研究人员从2034个推定分泌蛋白中鉴定出77个高度上调候选效应蛋白。五个候选可抑制Bax诱导细胞死亡，并被遗传学证明为C. fructicola在C. oleifera与苹果果实上完全毒力所必需。这些效应蛋白与感染C. oleifera叶片中宿主氧化应激响应改变相关，而宿主转录组揭示感染后防御与代谢通路广泛变化。结果为解析C. fructicola效应介导毒力机制提供基础，并识别出可用于RNA干扰（RNA-based silencing）策略防控C. fructicola的潜在靶标。
