《Molecular Plant Pathology》：GmERF109 Positively Enhances Soybean Resistance to Phytophthora sojae by Transcriptionally Activating GmG4DT-Like to Promote Glyceollin I Accumulation
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大豆疫病是由大豆疫霉（Phytophthora sojae）引起的毁灭性病害，对全球大豆（Glycine max）生产构成重大威胁。因此，提高作物对该病原菌的抗性是育种的重要目标。然而，大豆植株响应大豆疫霉侵染的信号机制，以及关键转录因子（Transcript
大豆疫病是由大豆疫霉（Phytophthora sojae）引起的毁灭性病害，对全球大豆（Glycine max）生产构成重大威胁。因此，提高作物对该病原菌的抗性是育种的重要目标。然而，大豆植株响应大豆疫霉侵染的信号机制，以及关键转录因子（Transcription Factor，TF）的调控网络和靶标仍不清楚。研究人员揭示了GmERF109的机制与功能，该基因在大豆抗疫霉Race 1抗感品种间表达不同，编码一个AP2/ERF转录因子。分子评价和抗病分析表明，GmERF109是定位于细胞核的转录因子，正向调控大豆对大豆疫霉的抗性。研究人员还证明GmERF109靶向并激活GmG4DT-like的表达，该基因通过过表达和RNA干扰（RNA interference，RNAi）分析被证实参与植保素glyceollin的生物合成。GmG4DT-like也增强对大豆疫霉的抗性。GmG4DT-like和GmERF109大幅提高glyceollin I异构体含量。总体而言，研究结果表明，GmERF109通过正向调控靶基因GmG4DT-like的表达促进glyceollin积累，从而改善大豆对大豆疫霉的抗性。这些发现为大豆抗大豆疫病机制提供了新见解，并将有助于培育抗病大豆品种。
研究背景方面，大豆疫病由大豆疫霉（Phytophthora sojae）引起，是全球大豆生产的重要威胁。植物通过以转录因子（Transcription Factor，TF）为核心的调控网络应对生物胁迫。AP2/ERF（APETALA2/Ethylene Responsive Factor）转录因子含AP2/ERF结构域，可结合GCC-box调控防御基因。大豆主要植保素（phytoalexin）包括daidzein、genistein和glyceollin I/II/III，其中glyceollin由daidzein前体经苯丙烷途径及异黄酮途径合成，关键酶含苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine Ammonia-Lyase，PAL）、4-香豆酸辅酶A连接酶（4-Coumarate-CoA Ligase，4CL）、查尔酮合酶（Chalcone Synthase，CHS）、异黄酮合酶（Isoflavone Synthase，IFS）以及异戊烯基转移酶4-二甲基烯丙基转移酶（4-Dimethylallyltransferase，G4DT）。已有NAC、MYB、HSF、WRKY等家族调控glyceollin生物合成的研究，但AP2/ERF转录因子是否调控该途径抗大豆疫霉仍不清楚。研究人员此前发现GmAP2为负调控因子，其过表达毛状根转录组中GmERF109显著下调，因此本研究聚焦GmERF109。
主要关键技术方法方面，研究人员以10个大豆品种为材料，其中5个大豆疫霉Race 1感病品种与5个抗病品种来自中国教育部的黑龙江省大豆生物学重点实验室；采用农杆菌（Agrobacterium）介导稳定转化大豆与发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）介导毛状根转化；通过RNA测序（RNA-seq）鉴定差异表达基因（Differentially Expressed Genes，DEG）；利用染色质免疫沉淀定量PCR（Chromatin Immunoprecipitation-qPCR，ChIP-qPCR）验证转录因子与启动子结合；采用本氏烟（Nicotiana benthamiana）双荧光素酶报告系统评估转录激活；以高效液相色谱串联质谱（High-Performance Liquid Chromatography–Tandem Mass Spectrometry，HPLC–MS/MS）定量glyceollin I；并进行体外大豆疫霉抑菌测定。
研究结果如下。2.1 GmERF109 Expression Differs Between Resistant and Susceptible Soybean Cultivars：研究人员对5个感病和5个抗病品种接种大豆疫霉后检测表达，发现感病品种中GmERF109无显著诱导或仅短暂弱诱导，抗病品种中其在12 hpi显著上调约2至8倍，说明该基因可能参与防御。
2.2 GmERF109 Is a Nucleus-Localized TF That Positively Regulates Resistance to P. sojae：研究人员构建GmERF109过表达（OE）与RNA干扰（RNAi）大豆，接种Race 1后，OE株系病斑和病原菌量降低，RNAi相反；亚细胞定位显示GmERF109-GFP在拟南芥原生质体细胞核；酵母GAL4系统证明其具转录激活能力。结论为GmERF109是核定位转录激活因子并正向调控抗性。
2.3 GmERF109 Positively Regulates the Expression of Glyceollin Biosynthesis Genes：研究人员对OE与野生型（Wild Type，WT）根进行RNA-seq，获226个DEG，上调基因富集于黄酮、苯丙烷和trihydroxypterocarpan dimethylallyltransferase活性等过程；RT-qPCR显示GmG4DT-like、GmG4DT、GmCHR6、Gm4CL3、GmCHI1B2、GmCHS7、GmIFS等在OE中升高、RNAi中降低，其中GmG4DT-like变化最显著。
2.4 GmG4DT-like Is a Direct Target of GmERF109：研究人员在候选基因启动子中仅于GmG4DT-like启动子?166 bp处发现GCC-box；ChIP-qPCR显示抗Myc抗体富集该区域；本氏烟双荧光素酶实验中，GmERF109激活野生型启动子，GCC-box突变后激活消失。结论为GmERF109通过GCC-box直接激活GmG4DT-like。
2.5 GmG4DT-like Positively Regulates P. sojae Resistance by Increasing Glyceollin I：研究人员构建GmG4DT-like的OE与RNAi毛状根，接种后OE几乎无病斑、病原菌量减少，RNAi更重；序列比对显示GmG4DT-like与GmG4DT氨基酸一致性82.6%且具NQxxDxxxD和KDxxDxEGD保守催化基序；蛋白定位于核与细胞质；glyceollin I含量在OE中升高、RNAi中降低；体外证实glyceollin I抑制Race 1生长。结论为GmG4DT-like通过促进glyceollin I增强抗性。
2.6 GmERF109 Enhances Resistance to P. sojae by Transcriptionally Activating GmG4DT-Like to Promote Glyceollin I Accumulation：研究人员测定发现GmERF109-OE根中glyceollin I高于WT，RNAi更低；在OE中GmG4DT-like、GmG4DT、GmNAC42-1分别约为WT的23.6、3.0、1.9倍，其他调控基因变化小；抗病品种中GmERF109与GmG4DT-like在12 hpi协同强诱导。结论为GmERF109主要通过强力上调GmG4DT-like促进glyceollin I积累。
讨论部分总结：研究人员指出GmERF109属AP2/ERF家族，在抗病品种被大豆疫霉快速强诱导，定位于核并结合GCC-box，与已知GmERF3等通过PR基因抗病的模式一致。GmG4DT-like具G4DT保守基序并可提高glyceollin I与抗性，证明其为glyceollin I途径新功能基因。已有GmNAC42-1、GmMYB29A2正调，GmWRKY72、GmJAZ1负调；本研究中GmERF109-OE下GmG4DT-like上调远超其他调控因子，说明其代表一条相对独立的AP2/ERF调控分支。该GmERF109–GmG4DT-like模块可解释部分品种间免疫差异，为抗疫霉育种提供新遗传资源。
研究结论部分翻译：综上，研究结果表明，GmERF109是一个关键转录因子，通过直接激活参与植保素glyceollin I生物合成的靶基因GmG4DT-like，增强大豆对大豆疫霉的抗性。该结果确立GmERF109–GmG4DT-like调控途径作为大豆防御分子机制的重要组成部分，为培育抗大豆疫霉大豆品种提供有价值的见解与遗传资源。论文发表于《Molecular Plant Pathology》。
