急性髓系白血病中靶向FLT3、KIT和RUNX1的多靶点植物化学物鉴定

《Scientific African》：Identification of multi-target phytochemicals against FLT3, KIT and RUNX1 in acute myeloid leukemia

　　

急性髓系白血病（AML）是一种血液系统恶性肿瘤，其特征是标准化疗和单靶点FLT3抑制剂所提供的持久治疗应答有限，这部分归因于分子异质性、获得性耐药以及FLT3、KIT和失调的RUNX1介导的协同致癌信号。该研究采用整合的系统药理学计算工作流程，筛选一个天然多靶点植物化学先导化合物库，这些化合物可能靶向AML中发现的这三种关键蛋白。通过对AML患者和健康对照RNA-seq数据进行转录组差异表达分析、加权基因共表达网络（WGCNA）和蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络分析，确认了驱动AML白血病增殖和髓系分化阻滞的顶级枢纽基因FLT3、KIT和RUNX1，并鉴定出异常的酪氨酸激酶信号通路是与AML相关的不良临床结局所涉及的首要通路。对植物化学物库进行系统性理化筛选，以鉴定满足Lipinski五规则、分子量、LogP和TPSA阈值以预测口服生物利用度的分子。九个高亲和力植物化学物命中物与FLT3、KIT和RUNX1已解析晶体结构的分子对接显示，在每个蛋白的功能口袋内形成稳定的氢键、π-π堆积和疏水接触，结合能在?7.9至?9.1 kcal/mol之间。研究人员的研究数据表明，这些植物化学物具有内在的多药理学活性，可同时抑制过度活跃的FLT3/KIT信号传导并恢复RUNX1转录。该研究提供了一个可重复的计算流程，用于在细胞中验证抗白血病功效，并鉴定出低毒性的天然小分子作为高危AML多靶点活性的治疗候选物。

急性髓系白血病（AML）是一种高度异质性的血液系统恶性肿瘤，标准细胞毒化疗和单靶点FLT3抑制剂虽有一定疗效，但持久应答有限，主要原因是分子异质性、获得性耐药以及FLT3、KIT和RUNX1失调所介导的协同致癌信号。这些因素促使研究人员探索能够同时靶向多个致病通路的多靶点治疗策略。天然植物化学物结构多样，具有多药理学特性，是潜在的多靶点药物来源。然而，目前尚缺乏将疾病转录组学、共表达网络、蛋白质相互作用分析、大规模植物化学物筛选和结构模拟整合起来同时研究FLT3、KIT和RUNX1的研究。因此，该研究旨在建立一套可重复的计算流程，以筛选能够同时靶向三大关键蛋白的天然先导化合物。

研究人员整合了来自GEO数据库GSE63646的AML患者（n=213）和健康对照（n=70）转录组数据，通过差异表达分析、WGCNA和PPI网络锁定核心枢纽基因；随后对约100万种植物化学物进行理化筛选和分子对接，并通过100 ns分子动力学模拟评估复合物稳定性。最终鉴定出九个多靶点植物化学物，如槲皮素、染料木素和小檗碱，它们能够同时结合FLT3、KIT和RUNX1的功能口袋。该研究为高危AML提供了低毒性的天然小分子候选药物，并建立了一个可重复的计算流程，论文发表于《Scientific African》。

在技术方法上，样本队列来自NCBI-GEO的GSE63646，含213例AML和70例健康对照。主要方法包括：转录组差异表达分析（阈值|log₂FC|>1，FDR<0.05）鉴定DEGs；WGCNA（软阈值功率28）构建共表达模块并关联临床性状；STRING构建PPI网络筛选前10个枢纽基因；GO和KEGG富集分析；从PubChem获取约100万化合物，按Lipinski五规则、MW、LogP、TPSA、可旋转键数进行类药性筛选；AutoDock Vina进行分子对接；GROMACS以CHARMM36力场进行100 ns MD模拟，分析RMSD、RMSF和Rg。

研究结果如下：

- Identification of Differentially Expressed Genes (DEGs) in AML：通过比较213例AML和70例健康对照的转录组，鉴定出4301个DEGs（上调2143个，下调2158个）。其中上调的包括FLT3、KIT、HOXA9等，下调的包括RUNX1、CEBPA等。热图表明这些基因可明确区分AML与正常样本。

- Weighted Gene Co-expression Network Analysis (WGCNA)：样本聚类未发现离群值；软阈值功率选择28以满足无标度网络；共划分10个模块。MEturquoise与AML状态、高危FAB亚型、不良细胞遗传学风险、FLT3-ITD和NPM1突变显著正相关；MEblack和MEblue与AML显著负相关。

- PPI Network Construction, Functional Enrichment, and Validation of Core Hub Genes：通过STRING构建PPI网络，按连接度排序得到前10位枢纽基因：FLT3、KIT、RUNX1、CXCR4、MYC、CDK1、CCNB1、STAT5A、BCL2、TP53。GO显示富集于细胞周期、激酶活性等；KEGG显示富集于AML通路、PI3K-Akt、MAPK、JAK-STAT通路。独立验证显示FLT3、KIT、RUNX1、CXCR4、MYC在70例AML中显著高于70例健康对照（P<0.001）。

- Structural Characterization of Key AML Hub Genes：利用蛋白晶体结构分析三个靶点的结构域。FLT3（PDB:4RT7）和KIT（PDB:6GQJ）均含胞外Ig样结构域、跨膜螺旋、近膜结构域和酪氨酸激酶结构域；RUNX1（PDB:1EAN）包含反式激活结构域和Runt同源结构域，后者直接结合DNA。

- Physicochemical Profiling and Drug-Likeness Assessment of a Large-Scale Phytochemical Library：对约100万化合物进行理化性质分析，大部分符合Lipinski五规则，HBA和HBD分别在0-10和0-5内，MW多数在150-500 Da，LogP在0-4；TPSA和可旋转键显示多数化合物具有良好口服生物利用度潜力。

- Molecular Docking Analysis：将筛选出的植物化学物对接到三靶点。结果表明，槲皮素、山奈酚和木犀草素与FLT3结合良好（槲皮素最佳，?9.1 kcal/mol）；染料木素、芹菜素和白杨素与KIT结合良好（染料木素最佳，?8.9 kcal/mol）；小檗碱、姜黄素和表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）与RUNX1结合良好（小檗碱最佳，?8.6 kcal/mol）。相互作用包括氢键、π-π堆积和疏水接触。

- Reference Ligand Analysis：在与已知参考抑制剂的对比中，天然化合物的对接得分均优于参考配体（Quizartinib ?5.4 kcal/mol，imatinib ?5.7 kcal/mol，Ro5-3335 ?4.8 kcal/mol），表明它们具有预测的高亲和力，但不等同于实验效力。

- Molecular Dynamic Simulation：对每靶点前两个化合物进行100 ns MD模拟。FLT3-槲皮素和FLT3-山奈酚的RMSD稳定在1.3-1.8 nm；KIT-染料木素稳定在1.3-1.5 nm，KIT-芹菜素约1.6-1.8 nm；RUNX1-姜黄素稳定在1.2-1.3 nm，RUNX1-小檗碱在1.5-1.7 nm。Rg值相对不变，表明复合物整体结构紧凑。

讨论部分指出，计算预测并不证明靶点抑制或治疗功效，而是提供可测试的分子相互作用假设。槲皮素、染料木素等植物化学物此前已被报道具有抗白血病活性，可能涉及多种机制；本研究预测的FLT3/K