《Sensors and Actuators B: Chemical》：Dual-Readout Cerium Oxide Nanoparticle Paper-Based Sensors for Redox Profiling via Hydrogen Peroxide Detection in 2D and 3D Chronic Lymphocytic Leukemia Models
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摘要翻译：活性氧（reactive oxygen species, ROS），尤其是过氧化氢（H?O?），在癌症生物学和疾病进展中发挥关键作用。然而，在复杂细胞模型中监测H?O?动态变化的可靠工具仍然有限，特别是那些兼具分析性能、可及性和操作简便性的工具。为满
摘要翻译：活性氧（reactive oxygen species, ROS），尤其是过氧化氢（H?O?），在癌症生物学和疾病进展中发挥关键作用。然而，在复杂细胞模型中监测H?O?动态变化的可靠工具仍然有限，特别是那些兼具分析性能、可及性和操作简便性的工具。为满足这一需求，研究人员开发了一种低成本纸基分析装置（paper-based analytical device, PAD），其整合了电化学（electrochemical PAD, ePAD）和智能手机辅助的光学/比色（optical/colorimetric PAD, oPAD）两种双读出模式。两种方法均采用氧化铈纳米颗粒（cerium oxide nanoparticles, nCe）作为纳米酶进行H?O?检测。该双读出策略在电化学（3 nM–500 μM线性范围，检测限0.4 nM）和光学（1–1000 μM线性范围，检测限0.3 μM）两种模式下均具有高分析性能，覆盖生理相关H?O?浓度，可在快速分析（<1分钟）中独立确认高度复杂生物系统中的H?O?水平，仅需5 μL样品，并表现出优异操作稳定性。在2D培养和3D慢性淋巴细胞白血病（chronic lymphocytic leukemia, CLL）共培养系统中的验证表明，该PAD能够监测肿瘤微环境模型中的氧化还原动态变化。这些结果凸显了整合双读出PAD在生物相关系统中进行可靠氧化还原分析的潜力，为分散式氧化还原传感及生物医学研究中的更广泛应用铺平了道路。
论文解读：
研究背景与问题：氧化应激是多种恶性肿瘤的标志性特征，活性氧（ROS）调控细胞存活、代谢及治疗反应。过氧化氢（H?O?）作为核心ROS，参与细胞信号传导、免疫调节、增殖和凋亡，但其过量产生会导致氧化应激、炎症、DNA损伤和肿瘤发生。准确量化H?O?对于生物医学研究和临床诊断至关重要。然而，传统检测方法如滴定法、分光光度法、化学发光法、色谱法和荧光法存在灵敏度有限、易受生物基质干扰或难以实时测量等问题。酶基电化学传感器虽灵敏，但受限于酶不稳定性和复杂固定化程序；普鲁士蓝修饰电极虽被称为“人工过氧化物酶”，但长期稳定性不足。纳米材料中，氧化铈纳米颗粒（nCe）凭借其Ce3?/Ce??动态氧化还原平衡、氧空位和缺陷丰富的萤石结构，具有过氧化物酶、过氧化氢酶和超氧化物歧化酶模拟活性，且兼具电催化和光学响应特性。但已有研究多将nCe用于酶偶联间接检测，直接检测生物基质中内源性H?O?尚不充分，且电化学与比色双模式集成于同一nCe传感器未见报道。纸基分析装置（PAD）具有低成本、便携、样品消耗低、兼容电化学和光学检测等优势，为构建集成化双模式传感平台提供了可行方案。
研究目的与设计：本研究旨在开发一种基于nCe的双模式PAD，同时实现高灵敏电化学检测和智能手机辅助比色分析，用于生物相关样品中H?O?的选择性灵敏检测，并应用于慢性淋巴细胞白血病（CLL）2D/3D共培养模型，监测肿瘤微环境中的氧化还原动态。
主要技术与方法：研究人员采用化学沉淀法合成nCe，并将其分散于1%壳聚糖溶液中以提高均一性和抑制团聚。选择Whatman 1 CHR滤纸作为基底，通过模板丝网印刷制备三电极体系（Ag/AgCl参比电极、碳对电极和工作电极），采用湿碳层滴涂nCe并室温过夜干燥的策略构建nCe-ePAD，并在电化学池周围添加硅胶疏水屏障以防止液滴泄漏。电化学检测采用安培法（施加电位?0.30 V vs. Ag/AgCl），光学检测利用nCe与H?O?反应产生的固有颜色变化，通过智能手机拍摄图像并提取RGB数值进行定量分析。生物验证在MEC-1人CLL细胞系（来源于DSMZ，ACC-497）与HK基质细胞（来源于Cytion，Cat. No. 300204）的共培养模型中进行，包括2D直接接触共培养和3D I型鼠尾胶原水凝胶共培养，并通过胎牛血清（FBS）浓度梯度（0%、1%、5%）模拟代谢应激和微环境支持缺失。
研究结果：
（1）nCe表征与纸基基底选择：扫描电子显微镜（SEM）显示nCe呈球形，尺寸15–20 nm，均匀分布在碳电极表面；能量色散X射线光谱（EDX）确认C、O、Ce元素组成（C 49.3%、O 24.9%、Ce 25.8%）；紫外-可见吸收光谱显示位于300 nm的特征吸收峰，对应O2?→Ce??电荷转移跃迁。在滤纸、色谱纸、普通纸和商用丝网印刷碳电极中，滤纸基ePAD表现出最佳电化学性能（峰电流比0.99，电荷转移电阻Rct=62 Ω），并对H?O?产生最高安培响应，故选用滤纸。
（2）nCe-ePAD优化与电化学性能：通过优化检测电位（?0.30 V）、nCe滴涂体积（10 μL）、nCe浓度（7.5 mg/mL）、壳聚糖含量（1%）和超声时间（30 min），构建了高性能传感器。安培响应在3 nM–500 μM范围内呈线性，线性方程?i (μA) = (0.7241 ± 0.009) lg[H?O?] (μM) + (1.908 ± 0.015)，r = 0.992，检测限0.40 nM，定量限1.35 nM。该范围覆盖血清（1–5 μM）和细胞内（1 nM–0.5 μM）生理相关H?O?水平。传感器长期稳定性优异，nCe粉末在干燥避光条件下可稳定至少两年，nCe-ePAD在12个月内响应保持在控制限内，RSD<10%。电极内和电极间精密度RSD<9%（n=5），可连续进行10次测量。选择性研究表明，抗坏血酸、葡萄糖和多巴胺等干扰物不产生显著电流响应，仅H?O?加入后电流明显增加。
（3）nCe-oPAD比色性能：基于nCe固有Ce3?/Ce??可逆氧化还原引起颜色变化，通过智能手机RGB分析在1–1000 μM范围内获得强线性响应，方程ΣRGB = ?72.7 (±6.7) log[H?O?] + 366.8 (±25.9)，r = 0.992，可区分生理和病理浓度。精密度评估显示RSD<10%（n=3）。
（4）生物样本回收与CLL模型验证：在人血清和含FBS细胞培养基中进行加标回收实验，在0.25–250 μM浓度范围内回收率定量可靠，证明其在复杂蛋白基质中的准确性。在2D和3D MEC-1共培养模型中，nCe-ePAD检测到：2D HK?（无基质细胞）在0% FBS时H?O?达到19.1 ± 6.0 μM，1% FBS为2.8 ± 0.3 μM，5% FBS为0.4 ± 0.2 μM；2D HK?（有基质细胞）在0% FBS时仅0.16 ± 0.01 μM，1% FBS为0.28 ± 0.01 μM，5% FBS为1.48 ± 0.75 μM。3D HK?在0% FBS时H?O?剧增至174 ± 14 μM，1% FBS为11 ± 1 μM；而3D HK?在0% FBS时仅为1.4 ± 0.1 μM，1%和5% FBS均约为0.3 μM。nCe-oPAD对2D HK?样品测得0% FBS为18.3 ± 1.5 μM，1% FBS为2.9 ± 0.1 μM，5% FBS为1.0 ± 0.4 μM，与电化学结果在较高浓度下良好一致。这些结果表明：MEC-1细胞在缺乏基质支持时对血清剥夺高度敏感，氧化应激急剧上升；HK基质细胞提供显著的细胞保护作用，可在营养限制条件下维持氧化还原稳态，尤其3D模型中保护效果更为明显。
讨论与结论：与现有传感平台相比，nCe-PAD的主要优势包括：同一纳米酶转导层同时产生电化学和比色信号，实现内部交叉验证，提高可靠性；无试剂设计简化了制备和操作；在2D和3D CLL共培养模型中均获得验证，超越概念验证。血清剥夺与基质共培养组合提供了简化的生理相关微环境撤除模型，可控制研究生存信号和氧化还原适应。结论部分总结指出，该研究报道了一种无试剂纸基分析装置，将氧化铈纳米酶催化与双模式转导相结合，实现对CLL模型中H?O?的快速灵敏测定。电化学与光学读出的整合增强了复杂生物基质中的分析可靠性，同时提供可用简单成像系统捕获的直观光学信号。该平台体现了纳米酶催化、纸基技术与双模式检测的协同作用，为白血病模型中氧化还原过程和氧化应激研究提供了多功能分析工具，未来将致力于改进装置集成并拓展至更多生物医学模型和分析场景。
