普通菜豆（Phaseolus vulgaris L.）种皮颜色与花纹遗传育种所需的基因组资源开发

《The Plant Genome》：Genomic resources to advance seed coat color and patterning genetics and breeding in common bean (Phaseolus vulgaris L.)

　　

种皮颜色与花纹是普通菜豆（Phaseolus vulgaris L.）的关键品质性状，决定市场类别并强烈影响消费者偏好与市场价值。这些性状由主要基因（有时存在上位性互作）的复杂网络调控，使得跨市场类别杂交后所需市场类别表型的恢复变得困难。尽管许多潜在位点已被遗传定位，但可用于中美国（Middle American）和安第斯（Andean）基因池间高效等位基因追踪的诊断型高通量分子标记仍有限。研究人员开发并验证了24个基因特异性PCR等位基因竞争延伸（PACE）标记，靶向7个主要种皮颜色基因（G、B、V、J、Rk、T和Z）与2个花纹基因（CPi和CSt），同时纳入已报道的采后种皮变暗位点（Psd）标记。另开发1个靶向Phaseolin（Phs）位点的PACE标记以区分中美国（S型）与安第斯（T型）基因池，作为种皮位点之外的遗传背景辅助工具。研究人员在三个多样性面板中评估标记表现，多数位点诊断准确率为90%–100%；但J、V、Rk、T和Z等位点需等位基因特异性标记或组合才能覆盖全部等位多样性。单倍型分析揭示市场类别间大量等位多样性及背景特异性互作。该研究所提供的基因锚定PACE标记可用于育种群体与种质资源中的快速精确等位追踪，促进市场类别特异性种皮性状的标记辅助选择（MAS），加速遗传改良。

研究背景方面，普通菜豆是全球最重要的食用豆类，种皮颜色与花纹决定市场类别、消费者接受度和商品价值。其性状由P、C、R、J、G、B、V、Rk、T、Z、C^Pi、C^St等主要与花纹基因构成复杂网络，P基因为显色总开关，C位点呈紧密连锁复合位点。育种中从外源市场类别或跨基因池导入抗病、产量、品质等位时，分离群体种皮表型紊乱，而传统RAPD、STS凝胶标记通量低、稳定性差，已有定位位点缺乏可常规使用的高通量诊断标记，因此亟需基因锚定的可扩展标记。

研究人员开展了如下研究：以5-593（PI 608674）为遗传背景的Bassett回交渐渗系、供体亲本、中美国多样性面板（MDP，n=315）与安第斯多样性面板（ADP，n=278）为材料，利用已公布候选基因与GWAS/连锁区间，比对显性/隐性等位重测序数据，在候选基因区内筛非同义SNP与插入缺失（INDEL），由3CR Bioscience设计等位特异性引物，建立基因特异性PACE标记，并在遗传标准材料与两类多样性面板中验证诊断能力、等位频率与单倍型结构；同时用Phs位点标记区分中美国与安第斯基因池。

论文结论为：研究人员开发25个基因特异性PACE标记（含Phs）加已报道P^sd标记，覆盖G、B、V、J、Rk、T、Z、C^Pi、C^St与Phs；多数位点诊断准确率90%–100%；J、V、Rk、T、Z因单标记无法覆盖全部单倍型，需多标记组合；MDP中pinto全带C^Pi，黑/粉/小红为C^pi，GN与navy因p隐性掩蔽呈混合；ADP中cranberry高频带C^St，DRK/LRK富集rk^d/rk，Andean面板G多为g^Calima，V以v^MDRK为主；Phs标记在野生-地方-栽培多样面板中准确区分S型/T型。该工作为跨市场类别杂交恢复目标种皮表型提供可靠工具，论文发表于《The Plant Genome》。

主要关键技术方法：研究人员使用USDA-NPGS提供的Bassett遗传渐渗系（53系+18供体），以及MDP（中美国，315份，含pinto、black、navy等）与ADP（安第斯，278份，含cranberry、DRK、LRK等）；对39份材料用Illumina NovaSeq 6000重测序，比对G19833 v2.1、UI111 v1.1、5-593 v1.1参考基因组，用IGV查看SNP/INDEL，挑候选基因内非同义变异设计PACE；以实时PCR荧光终点分型，在已知基因型材料中判读显性/隐性/杂合，再扩到多样性面板做等位频率与单倍型归纳；Phs另用274份野生/地方/栽培群体做基因池赋值验证。

研究结果如下。

3.1 种皮颜色与花纹基因特异性PACE标记开发：研究人员针对有强候选基因者（T、Z、J、V、Rk）在基因模型内找功能变异，对仅知区间者（G、B、C^Pi、C^St）围绕峰区设计多标记；共25个新PACE标记+PvbHLH12804（P^sd），在三类面板判定等位状态。

3.2 复杂C位点：研究人员指出C位点宜视为紧密连锁复合位点，C^Pi与C^St分别代表pinto斑纹与cranberry条纹亚基因；诊断PACE可追踪显性花纹等位。

3.2.1 Pinto花纹（C^Pi）基因：研究人员发现Bassett渐渗系多数为C^pi，仅6个白籽系带C^Pi但被p掩蔽；MDP中pinto 100%带C^Pi，黑/粉/小红全为C^pi，GN/navy因p隐性出现显性/隐性/杂合；ADP几乎全C^pi。结论：C^Pi-PACE-snp-UI111-Pv08-3360423-UI111是可稳健区分pinto/非pinto的诊断标记。

3.2.2 Striping pattern（C^St）基因：研究人员用Pv08两个错义SNP做PACE；ADP cranberry 95%带C^St，MDP全C^st，第二标记诊断力较弱；结论：首要C^St标记适合跨面板追踪cranberry条纹等位。

3.2.3 T基因：研究人员用Earliwax 1-bp缺失与65-73 39-bp缺失做两个t等位标记；MDP几乎全T，ADP全T，部分材料带t^65-73；结论：tt为局部着色前提，标记可辨部分着色遗传背景。

3.2.4 Z基因：研究人员用Earliwax非同义SNP与12-bp缺失做z标记；Andean面板z^EW频率极高，Middle American面板以Z为主；结论：Z调控带状着色，单标记可捕部分单倍型，全多样性需组合。

3.2.5 J基因：研究人员用Wit-rood boontje 1-bp缺失追非变暗，用V0919错义SNP追j^V0553；面板中J占优势，少数带j^V0553/j^WBR；结论：J位点的不同单倍型关联冠色/光泽/采后变暗，需多标记。

3.2.7 慢变暗（P^sd）：研究人员用已报道PvbHLH12804；MDP仅pinto 2.9%为P^sd，ADP为0%；结论：慢变暗等位在中美国部分浅色市场类存在，安第斯面板稀缺。

3.2.8 Rk基因：研究人员用UI111/Pink Floyd/CELRK/Montcalm错义SNP分rk^p、rk、rk^d；pink/small red富rk^p，DRK富rk^d，LRK富rk；结论：Rk候选ANR基因内等位可直接区分kidney类红度，是唯一表型对应清晰的功能等位位点。

3.2.9 G基因：研究人员把OAP3S/OAP7S/OU14S映射到Pv04异染色质25.2–35.9 Mb，做4个SNP标记；面板中Andean多为g^Calima，Middle American多为G；结论：G无克隆候选，标记为区间连锁工具而非因果标记。

3.2.10 B基因：研究人员在Pv02 49.3–49.4 Mb内做SNP与1-bp插入标记；black多B，pink/small red/navy富b^V0722；结论：B为暗紫/黑修饰因子，标记可用于深色素市场类筛选。

3.2.11 V基因：研究人员针对F3′5′H候选做6个单倍型标记（v^UI111、v^M0056、v^G28、v^G19833、v^MDRK等）；Andean以v^MDRK主导，pinto为v^UI111，GN混合；结论：V等位高度单倍型化，单一标记不能代表全场，需组合。

3.2.12 Phaseolin（Phs）位点与基因池分类：研究人员将Kami等15-bp串联重复PCR区定位到cupin簇Phvul.007G059800，做S/T错义PACE；在268份野生-地方-栽培面板与MDP/ADP中准确分中美国S型与安第斯T型；结论：Phs-PACE是基因池背景判别补充工具。

讨论与结论翻译：研究人员开发了锚定于G、B、V、J、Rk、T、Z、C^Pi、C^St与Phs的PACE标记体系；多数标记在遗传标准系与多样性面板诊断准确率90%–100%，J、V、Rk、T、Z需等位特异性或单倍型组合以覆盖全部多样性；单倍型分析显示市场类别间等位结构差异及背景特异性互作；该体系支持跨市场类别杂交中目标种皮表型恢复、慢变暗等位追踪与中美国/安第斯背景辨识，为普通菜豆类市场品质性状的标记辅助选择（MAS）与品种改良提供高通量、基因锚定、可重复的技术基础。