硝化抑制下固氮假单胞菌驱动的水稻响应与代谢组变化

《South African Journal of Botany》：Diazotrophic Pseudomonas driven response on rice and metabolome shifts under nitrification inhibition

　　

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  水稻作为全球50%人口的主食，排放CH₄和N₂O，亟需可持续解决方案。
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  Pseudomonas lini GHM32菌株及其卡兰宁（karanjin）促进植物生长，减少化学肥料使用。
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  Pseudomonas lini增强植物活力和抗逆性，减少排放，促进可持续农业。

引言

氮（N）对植物生长、发育以及从种子萌发到衰老的蛋白质合成至关重要。氮在农业生产中发挥着重要作用，影响作物质量和产量（Bascu?án-Godoy等人，2018年）。全球无机氮肥消费量从1961年的水平增长了91%（至2021年）（FAOSTAT，2023年），这导致了环境退化，尤其是通过甲烷（CH₄）和一氧化二氮（N₂O）等温室气体（GHG）排放。因此，提高氮肥利用率（NUE）对于可持续农业至关重要，可通过定向植物育种、改进农艺实践、生物固氮（BNF）和控制氮肥施用等方式实现（Udvardi等人，2021年；Kuchi等人，2021年；Quadriya等人，2024年）。目前，大量生物接种剂/生物刺激剂（微生物/微生物衍生产品）正日益应用于水稻、小麦、玉米、大豆和豆类等作物，在单独施用或与减少氮肥（约33-50%）结合施用时，效率接近100%。这些固氮剂的应用可提高植物生长、养分组成、NUE和产量（Bandyopadhyay等人，2017年；Imran等人，2021年；Zhang等人，2026年）。生物肥料的需求驱动型生产正以约8.6%的复合年增长率迅速扩张，全球市场预计将从2025年的27亿美元增长到2034年的56亿美元（Pulidindi，2025年）。

生物固氮可通过固氮酶基因的nifH基因作为分子生物标志物、¹⁵N同位素技术和乙炔还原试验进行评估（Gaby和Buckley，2014年）。环境因素和农业实践显著影响nifH基因转录的变化（Sharma和Singh，2017年）。通过逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测nifH基因，可显示特定时期的固氮酶表达水平（Zani等人，2000年）。植物是有机合成的天然专家，能够产生大量结构各异的特异性代谢物，帮助其适应各种生存挑战（Shen等人，2023年）。必须研究代谢物水平的变化，以更好地了解植物生长、发育、对环境变化的适应能力，以及食品、农业、医学和生物燃料研究（Chen等人，2014年，2016年；Peng等人，2017年；Qu等人，2020年；Zhan等人，2021年；Bai等人，2022年）。代谢谱分析是科学研究的重要进展，它整合了分析化学、统计学、生物信息学和生物化学，提供了解代谢物水平定量变化的策略，从而准确了解微生物、植物和哺乳动物代谢谱的变化（Keurentjes等人，2006年；Hu等人，2026年）。

联合国气候变化框架公约（UNFCCC）广泛监管各国CO₂、CH₄和N₂O的排放，因为其对气候具有持久或显著影响（UNFCCC报告，2022年）。Gupta等人（2021年）报告称，过去70年来印度的水稻种植增加了NO₂和CH₄的排放。硝化作用在全球氮循环和环境污染中发挥着关键作用。作为肥料添加剂的硝化抑制剂（NI）可显著延缓土壤中氮的硝化过程，因此可作为减少氮损失、提高氮肥利用率和增加作物产量的有效策略广泛使用（Abalos等人，2014年；Matse等人，2025年）。

硝化抑制剂（包括生物硝化抑制剂BNIs和合成硝化抑制剂SNIs）通过抑制氨向硝酸盐的转化，减少农业土壤中的氮损失。植物天然产生BNIs，而SNIs本质上是合成化学物质（Bozal-Leorri等人，2022年）。一项涵盖617个观测值的研究荟萃分析表明，3,4-二甲基吡唑磷酸盐（DMPP）、双氰胺（DCD）和氟啶脲等NI可有效分别减少60.1%、30.4%和36.1%的N₂O排放，此外还可减少硝酸盐（NO₃^?）淋溶，但同时也增加了氨（NH₃）挥发和铵（NH₄⁺）淋溶。总体而言，施用NI的环境和农业效益超过了相关风险，但由于其共存的正负环境影响，应谨慎选择和应用NI（Gao等人，2021年；Tufail等人，2023年）。一项涵盖19个荟萃分析的跨多样农业生态系统的大分析表明，NI在保持产量的同时将NOx排放降低了高达43%（Hayat等人，2025年）。

根分泌物如碳水化合物、脂肪酸、必需氨基酸、有机酸、水解酶、生长调节激素、维生素、核苷酸、类黄酮、多酚、甾醇、酰基高丝氨酸内酯和挥发性有机化合物起到化学信号的作用。这些化合物种类繁多，类似于植物用来与其他植物或生物体进行地下种间通信的信号。它们影响微生物活性、植物-微生物互作、调节氮转化和养分可用性，可通过改变土壤氮循环动力学来显著增强NUE并减少环境污染（Haichar等人，2014年；Van Dam和Bouwmeester，2016年；Coskun等人，2017年）。Guo等人（2026年）展示了养分和光照条件如何塑造与微生物接种相关的代谢组学变化的水稻根分泌模式。

某些分泌物（尤其是类黄酮）通过抑制负责将NH₄⁺转化为NO₃^?的微生物酶来抑制硝化作用，从而减少氮损失和N?O排放。这种生物硝化抑制（BNI）机制为减少合成肥料依赖的可持续农业提供了一种有前景的策略。这些化合物作为化学信号，可吸引根瘤菌和类似细菌，在作物周期内调节nod和其他固氮基因。这不仅提高了当前作物的氮可用性，还影响了土壤中的微生物组成和氮循环，对后续作物生长产生持久影响。它们通过改变土壤氮循环动力学提高农业氮肥利用率（ANUE），并减轻环境污染和气候变化（Coskun等人，2017年；Upadhyay等人，2022年）。

类似地，为了减少氮损失和温室气体排放，硝化抑制剂（NI）被用于减缓微生物将NH₄⁺转化为NO₃^?的过程。近年来，关于植物根分泌物以及土壤和植物微生物多样性如何相互作用影响养分循环的研究显著增加。本研究制定如下目标：i）调查原生固氮细菌P. lini GHM32及其在NI存在下的生物表面活性剂的潜在协同效应；ii）检验其在不同抑制剂处理氮肥条件下对nifH基因表达、水稻生长和根分泌物代谢组学变化的影响；iii）探索一种微生物辅助策略，以在水稻栽培中提高NUE并减少温室气体排放。

章节摘要

细菌分离与固氮筛选

P. lini GHM32通过系列稀释和涂布平板技术从Pusa 44水稻基因型的根际土壤中分离，随后在无氮Rennie培养基上进行纯化复培养（Rennie，1981年），并通过乙炔还原试验（ARA）（Hardy等人，1968年）和通过PCR方法扩增基因组DNA检测nifH（Poly等人，2001年）评估其固氮能力。

生物表面活性剂的生产和表征

将P. lini GHM32培养物接种到含有3 mL营养肉汤的试管中，在30°C下培养48小时和180

P. lini GHM32固氮筛选

在Rennie培养基中生长的P. lini GHM32的固氮能力通过基于nifH基因的引物PCR扩增基因组DNA（PCR产物大小为360 bp）和ARA试验进行验证，其中Rennie肉汤中的细菌培养物在本研究中产生3.74$\pm$0.05 μmol C?H?/mg蛋白/小时。

P. lini GHM32生物表面活性剂表征

P. lini GHM32的无细胞上清液在初步试验中呈阳性，即油位移、蓝琼脂、溶血和微孔板试验，这是生物表面活性剂的初步确认。

讨论

本研究强调了P. lini GHM32及其生物表面活性剂在NI存在下促进水稻生长、调节nifH基因表达和影响根分泌物代谢组学的潜力。本研究在Rennie培养基上培养的P. lini GHM32、nifH基因扩增和ARA试验证实了该细菌的固氮能力，类似于D?bereiner（1988年）和Ahmad等人（2006年）报道的其他固氮菌。根际细菌的固氮能力是一项重要特征，可直接或间接地

结论

在卡兰宁等NI存在下，使用P. lini GHM32或其生物表面活性剂处理，改善了水稻生长（21天后），减少了温室气体排放，并改变了根分泌物代谢组，与对照组（无菌水）相比无不利影响。来自P. lini GHM32及其生物表面活性剂的根分泌物揭示了14种与植物生长、硝化抑制、诱导系统获得性抗性和生物活性相关的代谢物，以及少量未表征的化合物。

研究局限与未来方向

作者承认，nifH基因表达的适度倍数变化可能反映了微妙的调控效应而非强烈的转录变化，此外可能存在一些GCMS伪影或实验室污染物。我们建议使用标准的代谢物伪影过滤方法、¹⁵N示踪实验以及在多样气候条件下的更广泛田间试验，从而增强转化相关性。

CRediT作者贡献声明

Humera Quadriya：撰写——初稿、验证、指导、软件、资源、方法论、调查、资金获取、正式分析、数据整理、概念化。Mohammad Imran Mir：撰写——初稿、指导、软件、资源、项目管理、方法论、调查、数据整理、概念化。Surekha Kuchi：撰写——初稿、验证、指导、资源、项目管理、方法论、数据整理，

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性经济利益或个人关系，这些利益或关系可能被视为影响本文所报告的工作。

致谢

作者感谢印度海得拉巴奥斯曼尼亚大学微生物学系和印度农业研究理事会-印度水稻研究所所长，特别感谢他们在试验期间在研究所和实验室提供的科学支持。

Humera Quadriya|Mohammad Imran Mir|Surekha Kuchi|Gobinath Rajendran|Radheshyam Yadav|Mohammed Mohibbe Azam|Satendra Kumar Mangrauthia|Khalid Rehman Hakeem|Bee Hameeda