乳腺和前列腺组织中从癌前病变到癌症发展的空间分布研究

《Cancer Discovery》：Spatial Mapping of the Precancer-to-Cancer Transition in Breast and Prostate

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摘要

乳腺癌和前列腺癌都是激素驱动的腺癌，它们经历了类似的侵袭过程。通过对完整肿瘤进行光片显微镜观察，我们识别出了癌前区域和侵袭区域之间的过渡界面。随后，我们开发了一种多模态连续切片工作流程，将体积重建与空间转录组学相结合。对51例中的319个空间分析结果进行分析，揭示了从癌前到侵袭性疾病转变的基因表达特征和新的结构见解。在乳腺癌中，MGP和PLAT的丢失与侵袭性转变相关，并在功能分析中促进了肿瘤发生。在前列腺癌中，随着侵袭性的进展，GDF15、ALDH1A3、ANPEP和FASN的表达上调，而在PC-3细胞中敲低这些基因则抑制了细胞的增殖和迁移。在非三阴性乳腺癌中，肿瘤相关巨噬细胞（SPP1+和MS4A6A+）的富集突显了免疫系统在侵袭性中的作用。

意义：我们定义侵袭性转变精确空间位置的方法可以直接探究这些转变的驱动因素，为这两种最常见的癌症提供了新的治疗靶点，并为研究肿瘤进展的空间机制提供了一个框架。请参阅Jing和Li的相关评论，第1720页。

引言

乳腺癌和前列腺癌分别是女性和男性中最常见的侵袭性癌症。尽管它们起源于不同的器官，但在其发展、进展和潜在的生物学机制上存在显著相似之处（图1A；参考文献1）。这两种癌症都依赖类固醇激素进行生长和发展，因此采用了类似的治疗策略来针对激素信号传导（2–4）。它们还共享一些遗传性的癌症起始机制，如BRCA1和BRCA2的突变（5, 6），以及形态学上的相似性，特别是在它们的上皮组织结构上。这两种组织都由两层主要细胞组成：内层的管腔细胞层和外层的基底细胞层，并负责分泌功能（乳腺产生乳汁，前列腺产生前列腺液；参考文献7, 8）。图1。

介绍

乳腺癌和前列腺癌是女性和男性中最常见的侵袭性癌症之一。尽管它们起源于不同的器官，但在发展、进展和潜在的生物学机制方面有显著的相似之处（图1A；参考文献1）。这两种癌症都依赖类固醇激素进行生长和发展，因此采取了类似的治疗策略来针对激素信号传导（2–4）。它们还共享一些遗传性的癌症起始机制，如BRCA1和BRCA2的突变（5, 6），以及形态学上的相似性，特别是在它们的上皮组织结构上。这两种组织都由两层主要细胞组成：内层的管腔细胞层和外层的基底细胞层，并负责分泌功能（乳腺产生乳汁，前列腺产生前列腺液；参考文献7, 8）。图1。

乳腺和前列腺癌在性别激素调控、遗传易感性、发育过程、组织结构、生理功能以及疾病进展时间线上存在相似之处。本研究分析的乳腺和前列腺癌转录组队列包括堆叠的3D数据、原始的3D数据和2D数据。Left部分展示了每个数据集的构成；Right部分显示了每个分析的样本数量和案例数量。堆叠的3D数据集利用Xenium、Visium HD、Visium、CosMx、CODEX和H&E成像技术，将具有连续切片的样本重建为3D肿瘤体积。原始的3D数据集通过光片显微镜处理以捕捉完整的3D结构。2D数据集仅包含没有连续切片的单个样本切片。

这些组织在肿瘤发生途径上也具有相似性，癌变通常起源于管腔细胞。在早期癌前阶段，周围的基底层保持完整，乳腺癌表现为导管原位癌（DCIS），前列腺癌表现为高级别前列腺上皮内瘤变（HGPIN）。这两种癌症的管腔细胞通常表达激素受体，如乳腺癌中的雌激素受体（ER）和孕酮受体（PR），以及前列腺中的雄激素受体（AR）。在从癌前到恶性转变的过程中，基底细胞层会被破坏，肿瘤细胞会扩散到周围环境中。因此，癌前病变通常具有减弱的基底层，表明向这种屏障丧失的进展。此外，DCIS和HGPIN都可能表现出相似的上皮细胞特征，如筛状结构（13）。尽管肿瘤进展在临床上非常重要，但这些转变的空间和分子动态，特别是在乳腺癌和前列腺癌中，仍然知之甚少。这在一定程度上是由于传统的二维（2D）单一模态方法无法完全捕捉肿瘤拓扑结构和肿瘤与微环境相互作用的复杂性。在这项研究中，我们开发了一种新的体积方法，结合了原始的三维（3D）数据和垂直重建的二维数据模态，以研究乳腺和前列腺组织中的恶性转变。我们首先使用3D光片显微镜对四个病例的14个组织块进行了成像，提供了整个组织块的高分辨率3D免疫荧光（IF）数据。我们报告了两种癌症类型的癌前病变和侵袭性癌变在3D形态上的差异。为了研究与这些转变相关的分子特征，我们开发了一种多模态3D连续切片方法，结合了空间转录组学（ST）、多重成像和组织学染色。我们包含了51个病例的319个分析结果，其中9个病例进行了连续切片，并使用了多种空间数据类型进行成像（图1B；补充表S1–S3）。此外，我们还需要了69个非连续切片的Xenium、CosMx、CODEX、Visium和Visium HD数据来补充我们的3D连续切片队列。这种3D连续切片方法可以从2D切片重建3D组织结构，为分析3D空间中的分子和形态变化提供了一个统一的框架。通过利用Xenium、CosMx、Visium、Visium HD和CODEX平台，我们整合了不同分辨率和生物标志物覆盖深度的数据，克服了单平台分析的局限性。利用这种方法，我们揭示了乳腺癌中DCIS向导管内癌（IDC）转变的机制，以及前列腺癌中正常腺体向Gleason 3期（GP3）转变的机制。我们识别出了差异表达基因（DEG）、空间关系和肿瘤微环境（TME）特征，这些特征对于上皮细胞状态的转变至关重要。此外，我们还提供了关于这些基因在关键转变中潜在作用的功能和机制见解。除了与其它癌症类型相关的技术流程外，这项研究还为理解乳腺和前列腺癌的进展提供了蓝图，并提出了潜在的治疗干预措施。

乳腺和前列腺癌转变研究队列概述

我们分析了51例患者的319个肿瘤和正常组织切片（2D）及组织块（3D），包括乳腺癌（112个分析，21个病例）和前列腺癌（207个分析，30个病例），作为NCI人类肿瘤图谱网络（HTAN；图1B；补充表S1–S3）的一部分。根据分析方法和策略，这些样本被分为三个队列：堆叠的3D队列、原始的3D队列和2D队列。堆叠的3D队列包含233个分析结果，其中76个来自乳腺癌，157个来自前列腺癌。我们使用了五种空间组学平台（Xenium、CosMx、Visium、Visium HD和CODEX），以及苏木精和伊红（H&E）成像技术，来重建3D肿瘤结构并研究与从非侵袭性到侵袭性状态转变相关的分子标记物（补充表S2–S5）。我们还增加了额外的2D切片，形成了一个非连续的2D分析队列，以增加DEG分析的样本量，共包含47个病例的305个切片。此外，我们还使用荧光光片显微镜（FLSM）进行了原始3D分析，以追踪3D中的腺体结构，并直接观察乳腺和前列腺癌从非侵袭性到侵袭性状态的转变。

体积光片显微镜揭示肿瘤结构

为了研究完整样本中癌前和侵袭性肿瘤体积的结构，我们使用FLSM对经过清洗和免疫染色的肿瘤组织进行了成像（图2A和B）。这项分析包括了两位乳腺癌患者的五个样本和两位前列腺癌患者的九个样本（图2A，“方法”部分）。细胞角蛋白-5（CK5）和泛细胞角蛋白（PanCK）分别用于标记基底细胞和上皮细胞，从而能够区分乳腺和前列腺癌组织中的正常、癌前和侵袭性病变（图2C和D）。

为了研究癌前和侵袭性肿瘤体积的结构，我们使用FLSM对经过清洗和免疫染色的肿瘤组织进行了成像（图2A和B）。该分析包括来自两名乳腺癌患者的五个样本和两名前列腺癌患者的九个样本（图2A，“方法”部分）。细胞角蛋白-5（CK5）和泛细胞角蛋白（PanCK）分别用于标记基底细胞和上皮细胞，从而能够区分乳腺和前列腺癌组织中的正常、癌前和侵袭性病变（图2C和D）。图2。

体积光片显微镜揭示了3D肿瘤结构。A部分展示了用于后续详细分析的样本信息，其中乳腺肿瘤和前列腺肿瘤分别用粉红色和蓝色突出显示。B部分展示了光片显微镜的实验工作流程示意图。肿瘤样本在成像前经过了组织清洗和抗体标记。C部分显示了乳腺癌样本HT944B1的3D视图。D部分显示了前列腺癌样本HT957Z1的3D视图。E部分展示了某一乳腺癌样本中的两个代表性DCIS区域，周围环绕着IDC和正常导管结构。C部分标注了这些区域。比例尺为100微米。F部分显示了ROI1中PanCK阳性区域中IDC（黄色）与DCIS（蓝色）的比例。G部分显示了E中ROI1的3D表面重建。比例尺为300微米。H部分展示了D中HT957Z1的选定区域ROI3，其中HGPIN（蓝色虚线曲线）向GP3/4（黄色虚线曲线）转变。IDC-P区域用橙色虚线突出显示。比例尺为100微米。I部分显示了Z方向上CK5阳性区域与PanCK阳性区域的比例随侵袭性转变而减少的情况。J部分展示了H中高级别PIN向GP3/4转变的3D重建。比例尺为200微米。所有图像中，CK5显示为白色，PanCK显示为红色。

为了研究DCIS和IDC结构之间的差异，我们将分析重点放在了通过病理学家复核确认具有IDC和DCIS特征的HT944B1样本上。这个7毫米×2.5毫米×1毫米的样本（补充视频S1）包含了大量但分布不均的PanCK阳性区域，而周边几乎没有任何CK5染色，表明存在IDC和基底层的不连续或缺失（图2C，E中的黄色箭头；补充视频S2和S3）。尽管在2D切片上IDC区域看起来是分离和分散的，但它们在整个肿瘤样本中是相互连接的，并且可以跨越较大的体积（补充视频S1、S2和S4；补充图1A），这与3D空间中的侵袭性和无控制生长模式一致。此外，还有六个明显的PanCK阳性区域在其周围有CK5染色。一些区域的CK5边界内有一层薄的PanCK染色，表明存在正常的导管结构，其中一层基底上皮细胞围绕着一层管腔上皮细胞（图2E，绿色虚线）。其他区域在CK5边界内有一个扩大的PanCK染色区域，表明乳腺癌导管中的恶性管腔细胞开始增殖，但基底层仍然完整（图2E，蓝色虚线）。DCIS的形态要么类似于一个大的均匀肿块[图2E，兴趣区域（ROI）1]，要么类似于扩张的导管结构[图2E，ROI2]。例如，在ROI1中标记的DCIS结构在z方向上超过了750微米，z方向垂直于切片方向（图2F）。具有完整CK5+基底层的区域似乎在整个观察体积中都保留了CK5层，这使我们推测侵袭性病变存在于采样区域之外。尽管如此，DCIS区域可以嵌入IDC区域中（图2G；补充动画S4）。最后，我们观察到一个区域，其中多个类似DCIS的区域嵌套在一个更大的结构中，强烈的CK5染色与PanCK染色的癌前细胞交织在一起（补充图S1B和S1C；补充动画S5）。我们认为观察到的结构是一个充满肿瘤细胞的乳腺小叶。由于我们的病理学家没有指出存在原位小叶癌，我们推测癌细胞起源于样本之外的DCIS区域，但通过导管系统侵入。为了研究高级别PIN和侵袭性前列腺肿瘤结构之间的差异，我们将详细分析集中在HT957Z1上，该样本同时具有正常的腺体结构、高级别PIN和侵袭性腺癌。该患者的病理报告显示前列腺腺泡腺癌，Gleason评分为4+3。我们在许多前列腺样本中观察到球形结构的明亮但不特异性的染色，我们怀疑这些染色是由淀粉小体捕获的抗体引起的（图2D；补充图S1D和S1E；补充动画S6）。我们推测这反映了患者的整体炎症状态。与乳腺癌样本类似，正常的前列腺导管和腺泡由外层的CK5和内层的PanCK标记（补充图S1E）。一些导管结构具有增厚的PanCK内层（25-50微米厚，而不是典型的约10微米厚），并且CK5边界完整，这表明它们是高级别PIN结构（图2H，蓝色虚线）。这些高级别PIN结构与周围无CK5的紊乱PanCK+分支结构相邻且似乎相连，这与Gleason评分为4的侵袭性模式一致（图2H，黄色虚线，以及补充动画S7）。实际上，CK5与PanCK的比例从0.4降低到0.1（图2I）。这种观察到的转变提供了肿瘤转变过程中的详细结构变化视图（图2J；补充动画S8）。此外，我们还观察到基底层有强烈CK5染色的导管结构，管腔内充满PanCK阳性细胞，这与在乳腺癌中观察到的DCIS形态类似。这些可能是前列腺的IDC（图2H；补充图S1F，橙色虚线）。总之，对完整的乳腺和前列腺肿瘤进行的FLSM显示，虽然在2D中看起来断开的区域，在3D中实际上是高度相连的，DCIS和高级别PIN病变嵌入其中和/或正在转变为侵袭性癌。这些分析强调了基底层完整性和上皮扩展如何定义结构变化，提供了非侵袭性和侵袭性形态的直接体积视图。

为了理解与结构转变相关的分子驱动因素，我们设计了一个多模式工作流程，整合了不同平台的空间分析。尽管典型的2D切片无法观察到第三维度的转变动态，但由于成像成本较低，它确实提供了大量数据。为了优化2D在成本与2D空间分析提供的有限视野之间的权衡，我们开发了一个实验和计算框架，用于使用五个平台（即H&E、Xenium、CosMx、CODEX和Visium系列）对组织块中的2D切片进行体积整合（补充图S2A）。来自混合切片的数据通过计算方式合并，提供了空间和结构变化的全面视图（补充图S2B）。简而言之，切片在特定间隔处切割，并根据每个平台的成像区域进行最佳排列。成像后，使用关键点工作流程对切片进行空间配准，实现切片之间的精确计算对齐（arXiv:1511.01154），然后对结果数据进行基因发现注释（“方法”）。产品是一个特定于块的计算配准切片图集，可以用来检查癌前到癌症的转变和相互连接的肿瘤体积。单独平台的2D切片通常无法完全表征转变，除非转变区域既足够线性，且切片方向与转变区域有巧合的匹配（补充图S2B）。我们方法中的计算配准的多切片能够捕获切片区域内的线性和非线性转变区域，不会留下拓扑上断开的转变区域图像片段。平台数据及其覆盖的相应基因的整合通过表达的接近相关性进一步支持了对转变连续体的计算推断（补充图S2C）。该方法用于在体积肿瘤块中寻找与癌症转变相关的ROI级别DEGs。实际上，这允许例如乳腺癌中的DCIS、微侵袭（MI）和IDC等区域沿着空间连续体进行全面检查。我们开发了两种方法来发现与这些相互连接的转变区域相关的基因：基于路径的方法和基于形态的方法（“方法”）。简而言之，在基于路径的方法中，我们计算了每个相互连接的3D体积内多个空间平台之间的单一相关值。回归是在沿转变上皮结构的路径上每个区域的表达值上进行的。在基于形态的方法中，所有被形态学上标注为非侵袭性的区域（例如DCIS）与同一平台内的所有侵袭性区域（例如IDC）进行了比较。我们还用涉及使用基底层标记评估区域肌肉上皮强度的2D方法补充了这些3D ROI级别的DEGs。使用这些标记，我们能够为每个区域分配一个侵袭性评分，该评分反映了该区域的基底层标记基因的丰度，并作为沿转变轴的形态和分子进展程度的连续指标。然后将该评分与基因表达相关联，从而识别与肌肉上皮完整性相关的队列级别基因（“方法”）。所有ROI中的转变区域都由经过委员会认证的病理学家进行了审查和验证。

首先，我们将我们的方法应用于确定与乳腺癌中DCIS到IDC转变相关的生物标志物。九个组织样本被连续切片（“方法”）。选择了两个切片深度较大的样本（460微米和120微米）进行基于ROI的分析，因为它们的增加的切片深度使得能够更清晰地可视化组织块在Z维度上的形态变化。HT704B1是一个450微米深的乳腺癌标本，其中包含DCIS和IDC区域，使用了五个空间平台进行分析：Xenium（n = 6）、CODEX（n = 12）、H&E（n = 20）、CosMx（n = 4）和Visium HD（n = 2；图3A；补充动画S9和S10）。对这些切片的3D分析显示，在2D空间中相隔超过5毫米的区域在Z平面上实际上是相互连接的（图3B；补充表S6），这突显了连续切片对于理解真实形态关系的重要性。我们分析了两个感兴趣的区域，ROI1和ROI2，并识别出与DCIS到MI再到IDC转变相关的共同代谢、上皮完整性和增殖模块（图3C–E；补充动画S11和S12）。例如，ROI1中的DCIS表现出HMGCS2的持续表达（R2 = 0.79，P = 0.003：基于路径）和TFF1（R2 = 0.82，P = 0.002：基于路径），这在相互连接的IDC体积中消失了（图3D）。此外，ROI2中的DCIS表现出PLAT的强烈表达，在MI部位显著降低（图3E）。TFF1和PLAT可能在维持上皮完整性方面发挥作用，可能限制肿瘤细胞的迁移和侵袭性（14-18）。HMGCS2促进酮生成，使脂质衍生的能量得以产生（19），可能在DCIS区域常见的缺氧条件下增强癌前细胞的存活（20）。在IDC中，我们观察到两个参与细胞增殖的基因在ROI1中上调，TCIM（FC = 0.60：基于Xenium的形态学；参考文献21）和MKI67（FC = 0.47：基于Xenium的形态学），以及在ROI2中的血管生成因子VEGFA（R2 = 0.74，P ≤ 0.001；基于路径；参考文献22）（图3D和E）。TCIM通过激活Wnt/β-连环蛋白通路（21）可能在诱导侵袭性癌细胞增殖中发挥作用，这由MKI67标记。图3。C部分，左侧显示了HT704B1 ROI1中的相互连接的区域。每个区域都根据数据类型进行了着色，并标出了路径的DCIS轴和IDC轴。右侧显示了每个相互连接区域的2D横截面（黄色轮廓）。每个区域的形态（DCIS、MI和IDC）都展示在横截面的上方。每个横截面都标有Z轴上的深度，并根据数据类型进行了着色（蓝色：Xenium；绿色：Codex；紫色：H&E；棕色：CosMx；金色：Visium HD）。D部分，左侧显示了HT704B1 ROI1中的相互连接的区域。右侧显示了从DCIS到IDC的基因表达变化（黄色轮廓）。展示了Xenium和Visium HD区域。显示了TFF1（青色，与DCIS相关）和TCIM（橙色，与侵袭性相关）的转录本，以及HMGCS2（蓝色，与DCIS相关）和MKI67（黄色，与侵袭性相关）的转录本。对于Xenium区域，每个转录本的位置都用一个点表示。对于Visium HD，每个含有至少1个给定基因转录本的2-μm网格方格都用一个点表示。E部分，显示了HT704B1 ROI2中的相互连接的区域。每个区域都根据数据类型进行了着色。每个横截面都显示了该区域的形态（DCIS和MI）。对于Xenium区域，展示了Z0和Z245的HMGCS2（蓝色，与DCIS相关）和MYC（橙色，与侵袭性相关）。对于Visium HD区域，展示了Z5和Z250的PLAT（绿色，与DCIS相关）和VEGFA（黄色，与侵袭性相关）。对于Xenium区域，每个转录本的位置都用一个点表示。对于Visium HD，每个含有至少1个给定基因转录本的2-μm网格方格都用一个点表示。F部分，显示了从DCIS到IDC（ROI1）和从DCIS到MI（ROI2）的每个相互连接区域的基因表达变化。与DCIS相关的（左侧）和与IDC相关的（右侧）基因根据它们的主要生物学功能进行了分组。每个相互连接区域的面积标准化、Z轴缩放的表达值都进行了展示。背景颜色对应于给定横截面上相应区域的形态。基因的正斜率表明其与区域的侵袭性轴有关，而负斜率表明其与DCIS轴有关。对于数据点数量≥3的每个基因，都包含了R2和P值。数值通过ROI1（青色）和ROI2（蓝色）进行了颜色编码。关闭图3。除了HT704B1，我们还在HT206B1（一种三阴性乳腺癌（TNBC）样本）中注释了ROI（见补充图3A；补充动画S13）。在ROI1中，我们识别了一个从DCIS过渡到IDC的相互连接区域（见补充图S3B；补充动画S14）。在ROI1的IDC区域，我们观察到MYC（R2 = 0.89，P ≤ 0.001；基于路径）和MKI67（R2 = 0.68，P = 0.006；基于路径）的上调，这两者都是增殖和侵袭性的标志物（23, 24）。相反，DCIS区域显示出CDKN1A（R2 = 0.90，P = 0.05，基于路径）和CA9的表达升高。与MYC和MKI67不同，CDKN1A是细胞周期的负调节因子，可能在DCIS区域中发挥维持较低增殖表型的作用（25）。此外，DCIS缺氧区域中缺氧诱导的标志物CA9的上调表明，除了HMGCS2提供的脂质来源的能量外，CA9可能通过帮助DCIS细胞适应缺氧环境来支持其存活（26, 27）。除了上述基因外，我们还识别了在多个ROI中共享的额外机制，这些机制可能有助于推动从DCIS到IDC的转变（见图3F；补充图S3C和S4）。在DCIS区域，参与了组织结构和重塑的基因（TFF1、PLAT和MGP；参考文献14–16、18、28）、导管形成和分化（KIT和PIP；参考文献29、30）以及代谢（HMGCS2；参考文献19）的表达增加。IDC区域显示出与增殖相关的基因（TCIM和MKI67；参考文献21）、血管生成（VEGFA和CP；参考文献22、31、32）以及代谢（GLUL和FASN；参考文献33、34）的上调。这些基因表达的变化共同反映了从有组织、低侵袭性的表型向高度增殖和侵袭性癌细胞状态的转变。

在乳腺癌的研究方法类似的情况下，我们的目标是识别出从正常前列腺腺体组织到侵袭性GP3区域的3D表达模式。我们分析了两个样本HT891Z1和HT913Z1，它们的形态涵盖了正常腺体、HGPIN和GP3区域（见图4A和B；补充动画S15和S16）。这些样本被连续切片到575 μm（HT891Z1）和620 μm（HT913Z1）的深度。使用前述的DEG探索程序，我们识别出了与这种进展相关的假定标志基因，并从每个样本中选出了两个ROI进行详细的3D分析（“方法”部分）。图4。

A部分，显示了HT891Z1（前列腺腺癌）的连续切片示意图，其中包含了54个切片，分别使用Xenium（n = 10）、CODEX（n = 16）、H&E（n = 24）、CosMx（n = 2）和Visium HD（n = 2）技术，覆盖了575 μm的深度。H&E切片上显示了3D ROI ROI1（青色）和ROI2（蓝色）。B部分，放大了H&E切片的视图，并标注了正常、HGPIN和GP3上皮区域。还显示了相邻的Xenium和CODEX图像。C部分，左侧显示了HT891Z1 ROI1中的相互连接区域。每个区域都根据数据类型进行了着色，并标出了路径的正常轴和GP3轴。右侧显示了每个相互连接区域的2D横截面（黄色轮廓）。每个横截面都展示了该区域的形态（正常、HGPIN和GP3），并标有Z轴上的深度，并根据数据类型进行了着色（蓝色：Xenium；绿色：Codex；紫色：H&E；棕色：CosMx；金色：Visium HD）。D部分，显示了从正常到GP3的基因表达变化（黄色轮廓）。展示了Xenium和Visium HD区域。显示了FAS（青色，与正常相关）和MYC（橙色，与侵袭性相关）的转录本，以及SOX9（绿色，与正常相关）和GDF15（黄色，与侵袭性相关）的转录本。对于Xenium区域，每个转录本的位置都用一个点表示。对于Visium HD，每个含有至少1个给定基因转录本的2-μm网格方格都用一个点表示。Z340和Z290图像块中的黄色和白色指示箭头表示两个分支区域合并的位置。E部分，显示了HT891Z1 ROI2中的相互连接区域。每个区域都根据数据类型进行了着色。每个横截面都展示了该区域的形态（正常、HGPIN和GP3）。对于Xenium区域，展示了Z0和Z245的HMGCS2（蓝色，与DCIS相关）和MYC（橙色，与侵袭性相关）。对于Visium HD区域，展示了Z5和Z250的PLAT（绿色，与DCIS相关）和VEGFA（黄色，与侵袭性相关）。对于Xenium区域，每个转录本的位置都用一个点表示。对于Visium HD，每个含有至少1个给定基因转录本的2-μm网格方格都用一个点表示。F部分，显示了每个相互连接区域从正常到GP3的基因表达变化。与正常相关的（左侧）和与HGPIN/GP3相关的（右侧）基因根据它们的主要生物学功能进行了分组。每个相互连接区域的面积标准化、Z轴缩放的表达值都进行了展示。背景颜色对应于给定横截面上相应区域的形态。基因的正斜率表明其与HGPIN/GP3轴有关，而负斜率表明其与正常轴有关。对于数据点数量≥3的每个基因，都包含了R2和P值。数值通过ROI1（青色）和ROI2（蓝色）进行了颜色编码。关闭图4。

在HT891Z1中，我们分析了两个ROI，ROI1和ROI2，它们捕捉了从正常腺体通过HGPIN到GP3形态的转变（见补充动画S17和S18）。在HT891Z1 ROI1中，沿正常–HGPIN–GP3轴的基因表达显示出明显差异（见图4C）。在较少侵袭性和正常区域，我们观察到FAS（R2 = 0.53，P = 0.026；基于路径）的表达增加。FAS编码Fas细胞表面死亡受体，通过形成死亡诱导信号复合体来促进凋亡，启动caspase级联反应，最终导致程序性细胞死亡（见图4D和E；参考文献35、36）。相反，在从正常到GP3的转变过程中，我们观察到GDF15（R2 = 0.68，P = 0.006；基于路径）和MYC（R2 = 0.58，P = 0.016，基于路径）的表达上调，其表达随着乳腺癌的进展而增加（见图4E）。GDF15属于TGF-β超家族，已被证实与骨转移和前列腺癌对雄激素治疗的抵抗性进展有关（37），但在前列腺癌的早期阶段没有这种作用。值得注意的是，在ROI1的Z290切片中，我们观察到同一切片上正常和HGPIN表达模式的显著差异。在腺体的右侧检测到FAS，而左侧显示了MYC和GDF15的表达升高。后续的Z切片显示这两侧分化为不同的形态，右侧保持了前列腺腺体的正常特征，而左侧则向HGPIN形态转变。在HT913Z1中，ROI1显示了一个正常导管向GP3形态的转变（见补充图S5A和S5B；补充动画S19）。在正常轴上，我们使用Xenium在多个切片中观察到SORL1的表达升高（见补充图S5C），这是一种在前列腺癌中之前未描述的基因，但它通过与低密度脂蛋白受体等受体的相互作用参与脂质代谢（38）。在HT913Z1的侵袭性轴上，我们观察到SERPINA3的表达上调，其表达模式仅限于特定的GP3区域。SERPINA3参与了多种过程，包括介导凋亡、自噬和有氧糖酵解，从而影响细胞存活和代谢途径（39）。此外，在黑色素瘤中，高水平的SERPINA3表达与细胞外基质（ECM）的重塑、侵袭性增加和总体生存率降低有关，这表明了类似的促侵袭性作用（40）。最终，我们确定了多个感兴趣区域（ROIs）中共享的通路，这些通路可能有助于推动从正常状态向恶性转化（GP3）的转变（图4F；补充图S4和S5C）。在腺体形态基本正常的区域，我们观察到与腺体分化和激素信号传导相关的基因上调（FHL2和SOX9；参考文献41, 42），上皮-间质转化（EMT）受到抑制（SORL1、NTN4和FLRT3；参考文献43–45），组织完整性相关基因（UPK1A；参考文献46）以及生存相关基因（FAS；参考文献35）和代谢相关基因（SLC40A1；参考文献47）上调。相比之下，在具有更明显恶性转化特征的HGPIN和GP3区域的基因表达增加，这些基因与迁移和血管生成（GDF15、MYC和EPHA6；参考文献37, 48, 49）、代谢和细胞间通讯（ALDH1A3；参考文献50）、组织完整性（SCIN；参考文献51, 52）、生存（SERPINA3；参考文献39）以及细胞增殖和分化（NPDCD1；参考文献53）有关。总的来说，这些基因表达的变化反映了前列腺癌从非侵袭性向侵袭性转变过程中的生物学变化。

除了上皮细胞标记物外，我们还探索了可能促进从正常上皮细胞向更具侵袭性上皮细胞转变的肿瘤微环境（TME）的变化。我们确定了两种可能参与这一转变的TME细胞类型：肿瘤相关巨噬细胞（TAM）和癌症相关成纤维细胞（CAF）。利用我们的2D自动化基因发现流程（图5A），我们找到了两个标记物SPP1和MS4A6A，它们可以区分非浸润性乳腺癌（TNBC）不同形态区域中的TAM群体（图5B）。在HT704B1 ROI1中，我们分析了整个Z轴切片堆栈中SPP1和MS4A6A的表达情况，发现MS4A6A+的TAM主要浸润在导管原位癌（DCIS）区域，而SPP1+的TAM则在浸润性导管癌（IDC）区域更为常见（图5C和D；补充图S6A和S6B）。有趣的是，只有管腔细胞起源的乳腺肿瘤表现出这种关系，而基底细胞起源的肿瘤则不同，其SPP1+和MS4A6A+ TME的表达与非侵袭性形态相关。与TNBC类似，在前列腺癌中，我们也观察到MS4A6A+的TAM主要分布在非侵袭性区域。为了进一步在三维空间中评估这种关联，我们使用了HT704B1的所有Xenium切片进行了分析。对于每个TAM，我们计算了它到最近上皮区域的最短3D距离，并量化了相应上皮区域的基底层强度得分作为侵袭性的指标。在分析的六个切片中的五个切片中，SPP1+的TAM主要与基底层完整性得分较低、更具侵袭性的上皮区域相关，而MS4A6A+的TAM则更常位于基底层完整性得分较高的非侵袭性区域附近（补充图S6C）。

TAMs和CAFs对恶性转化的影响：A，TME区域富集基因识别过程的示意图。使用位于侵袭性和非侵袭性区域20微米范围内的基因，将其与整个队列中的基底标记物表达进行关联。B，TAMs和CAFs中非侵袭性和侵袭性富集基因的分布图。展示了所有2D和3D数据集中基底层负相关性的分布情况。每个点（按数据类型着色）代表一个切片的关联值。低侵袭性评分表示该基因在基底层标记物高表达的区域中过度表达（即与非侵袭性区域相关；浅绿色背景），而高侵袭性评分表示该基因在基底层标记物低表达的区域中低表达（即与侵袭性区域相关；浅红色背景）。虚线水平线表示平均侵袭性评分的临界值。C，展示了HT704B1的3D ROI1中Xenium、CosMx和Visium HD切片中MS4A6A+（青色，与侵袭性相关）和SPP1+（橙色，与非侵袭性相关）TAMs的转录本分布。D，HT704B1 ROI1的放大区域显示了MS4A6A（青色）、SPP1（橙色）和其他TAM标记物（紫色，CD14；绿色，CD68；黄色，CD163）的情况。图5。

CAFs也与肿瘤细胞状态有明显的关联，并在调节TME中发挥着关键作用。在非TNBC乳腺切片中，我们观察到侵袭性区域周围的关键间质基因——MFAP5和ASPN——上调，这些基因有助于肿瘤进展（图5B和E）。MFAP5是一种由成纤维细胞分泌的ECM糖蛋白，通过重塑ECM并激活PI3K/AKT和TGF-β信号通路来促进癌细胞侵袭（54–56）。它还通过上调VEGF来增强血管生成，促进肿瘤血管化（57）。ASPN是一种由CAFs分泌的蛋白聚糖，通过与胶原蛋白和其他ECM成分相互作用来调节ECM的硬度（58, 59）。总之，SPP1+巨噬细胞在侵袭前沿的空间富集表明炎症信号传导、ECM重塑和免疫调节共同作用，为上皮细胞的逃逸创造了有利环境（60, 61）。同时，表达MFAP5和ASPN的成纤维细胞参与基质重塑和促血管生成信号传导，改变了组织的生物化学和生物力学特性。这些免疫和间质程序与转化中的上皮细胞的共存表明，恶性侵袭源于上皮细胞与微环境之间的协调相互作用。

肿瘤异质性是一个主要挑战，因为没有一个单一的分子过程在所有肿瘤或所有病例中都是普遍存在的。然而，我们的分析突出了几个与乳腺和前列腺癌从非侵袭性状态向侵袭性状态转变相关的基因表达模式（图6A；补充图S7A和S7B）。总体而言，这些转化基因可以分为三类：在乳腺中富集的基因、在前列腺中富集的基因以及在这两种癌症类型中都共有的基因。图6。

在乳腺和前列腺癌中，从非侵袭性到侵袭性的转变机制具有共同性和多样性：A，左侧显示了在乳腺（红色）和前列腺（蓝色）癌症中富集的非侵袭性标记物（绿色斜率）和侵袭性标记物（紫色斜率）。基因根据颜色块进行了功能注释。B，右侧展示了在乳腺样本HT206B1、HT323B1和HT397B1中DCIS标记物MGP的CODEX验证结果。黄色框表示IDC区域，绿色框表示DCIS区域。这些位置的放大视图也被展示出来。C，展示了HT704B1乳腺癌样本中非侵袭性管腔细胞标记物PLAT的CODEX验证结果。D，在前列腺样本HT935Z1中，使用DAPI（蓝色）和PanCK5（红色）对GDF15（绿色）进行了免疫组化（IF）验证，结果显示GP3+区域的GDF15表达增加，而在正常腺体中未表达。E，在前列腺样本HT891Z1中，使用DAPI（核，蓝色）、CK5（基底，绿色）和ECAD（上皮，青色）对侵袭性上皮标记物ALDH1A3（红色）进行了IF验证，结果显示GP3+区域的ALDH1A3表达增加。CK5（绿色）、ALDH1A3（红色）和ECAD（青色）也分别单独展示出来。图6。

在乳腺癌中，与组织完整性和重塑相关的基因——包括MGP和PLAT——在多个样本的非侵袭性状态（DCIS）中一致富集（图6A；补充图S7A和S7B）。此外，如KIT和CA9等标记物也在HT206B1的ROI水平上定位在DCIS区域（补充图3）。相比之下，IDC区域则以与血管生成相关的基因为特征，KRT8和VEGFA在队列水平上富集，CP在ROI分析中富集（图3F、6A和B）。IF验证进一步证实，与IDC相比，MGP蛋白在DCIS中显著上调（正常与IDC：P = 1.29e?4，DCIS与IDC：P = 3.81e?8；双侧Student t检验；图6B；补充图S8A；补充视频S20）。MGP是一种含有γ-羧基谷氨酸结构的蛋白，在抑制软组织钙化、维持ECM完整性方面起着关键作用，通过防止不适当的钙沉积来确保ECM的柔韧性和功能（62）。在癌前状态下，维持ECM的组织结构至关重要，因为失调——例如由于矿化导致的硬度增加——可能通过改变ECM的组成和结构来促进肿瘤侵袭和进展（28, 63）。同样，PLAT蛋白在非侵袭性乳腺区域显著富集（正常与IDC：P = 3.81e?4；DCIS与IDC：P = 0.009；双侧Student t检验；图6C；补充图S8B）。在前列腺癌中，非侵袭性区域表达了与ECM相关的基因，如UPK1A和FLRT3。ANPEP和ALDH1A3与细胞间通讯和代谢有关（64, 65），在侵袭性前列腺癌区域上调，但在侵袭性乳腺区域下调。我们还通过IF验证了一些侵袭性驱动因素，包括GDF15（P = 0.031；双侧Student t检验；图6D；补充图S8C）和ALDH1A3（P = 3.46e?6；双侧Student t检验；图6E；补充图S8D），这两种基因在侵袭性病变中的表达均显著高于正常腺体。GDF15是一种TGF-β家族中的应激诱导细胞因子，已知可促进EMT和肿瘤进展（37, 66, 67）。最后，有几个基因在两种癌症类型中都一致富集，包括FASN（补充图S8E和F；脂肪酸合成酶），它通过提供快速增殖细胞所需的脂质来促进肿瘤进展（68），以及EPHA6（补充图S8G），这是一种Eph受体酪氨酸激酶家族的成员，参与细胞间通讯，并已被证实与前列腺癌的转移有关（49）。然后，我们选择了在转录和蛋白质水平上都显示一致趋势的候选转化标记物，以便在患者来源的细胞系中进行功能验证。在乳腺癌研究中，我们使用了短发夹RNA（shRNA）来下调患者来源的导管原位癌（DCIS）细胞系ETCC-006和ETCC-010中的非侵袭性组织重塑相关基因MGP和PLAT（69）。实时定量PCR（RT-qPCR）证实了转录水平的显著降低（P < 0.005），功能测定也显示了与基因下调相关的显著效应（图7A）。CCK-8实验表明，在转染后24至120小时的时间点内，沉默这两个基因均能增强细胞增殖能力；伤口愈合实验则显示迁移速度加快，这表现为24小时时伤口闭合得更迅速（图7B–D；补充图S9）。这些结果表明，MGP或PLAT的丢失会促进细胞的增殖和迁移行为，这与它们在维持DCIS中的保护作用一致。图7。查看大图/下载幻灯片。

**乳腺和前列腺转化标志物的功能验证：**
A. RT-qPCR确证了shRNA在患者来源的乳腺癌细胞系（ETCC-006和ETCC-010）中对MGP和PLAT的下调作用。使用ACTB作为标准化对照，通过ΔΔCt方法分析RT-qPCR数据。表达水平相对于ACTB进行了标准化，并与阴性shRNA对照组进行了比较。其中一个对照样本的表达值被设为1，所有其他值均据此进行缩放。条形图表示平均相对表达值±标准误差（n = 3）。显著性值通过双侧Student t检验计算得出。星号表示显著结果（*，P < 0.05；**，P < 0.01；***，P < 0.001）。
B. 增殖实验显示，在抑制MGP和PLAT后，乳腺癌细胞系的生长在24至120小时内增加。条形图表示细胞存活率百分比±标准误差（n = 3）。显著性值通过双侧Student t检验计算得出。星号表示显著结果（*，P < 0.05；**，P < 0.01；***，P < 0.001）。
C. 伤口愈合实验显示，在MGP和PLAT下调后，24小时内迁移速度加快。
D. 伤口愈合实验的代表性图像显示，在MGP/PLAT下调的乳腺癌细胞系中，24小时内伤口闭合情况得到改善。
E. RT-qPCR确证了shRNA在PC-3前列腺腺癌细胞中对GDF15、FASN、ALDH1A3和ANPEP的下调作用。表达水平相对于GAPDH进行了标准化，并与阴性shRNA对照组进行了比较。条形图表示平均相对表达值±标准误差（n = 3）。显著性值通过双侧Student t检验计算得出。星号表示显著结果（*，P < 0.05；**，P < 0.01；***，P < 0.001）。
F. 增殖实验显示，在抑制GDF15、FASN、ALDH1A3和ANPEP后，PC-3细胞在24至120小时内的生长减少。条形图表示细胞存活率百分比±标准误差（n = 6）。显著性值通过双侧Student t检验计算得出。星号表示显著结果（*，P < 0.05；**，P < 0.01；***，P < 0.001）。
G. 伤口愈合实验显示，在抑制GDF15、FASN、ALDH1A3和ANPEP后，迁移速度减慢，72小时时伤口闭合延迟。相对表达百分比计算公式为（0小时面积-72小时面积）/ 0小时面积，然后将该百分比归一化到对照组水平。
H. 伤口愈合实验的代表性图像显示，在0至72小时的时间点内，下调的PC-3细胞系的伤口闭合情况比对照组更差。查看大图/下载幻灯片。

**讨论：**

在这项研究中，我们提出了一个全面的框架，用于理解具有某些共同特征的乳腺癌和前列腺癌的肿瘤进展空间动态。通过结合多模态3D连续切片工作流程和光片显微镜技术，我们识别了从正常上皮细胞到癌前细胞再到侵袭性上皮细胞状态转变的关键机制。通过整合转录组学、多重成像和组织化学染色技术，我们超越了传统2D分析的固有局限，提供了肿瘤结构和肿瘤微环境（TME）相互作用在三个维度上的统一视图，并在空间定义的基因表达模式背景下进行了分析。尽管取得了这些进展，但由于不同平台在检测分辨率、基因覆盖范围和采样密度上的差异，跨平台的数据整合仍然具有挑战性，这可能会影响特征检测的一致性。此外，组织内在的异质性也给3D重建和后续分析带来了挑战，因为同一组织内不同区域可能表现出不同的基因表达趋势，从而导致不同研究区域之间以及不同队列层次之间的关联性存在差异。此外，生成大规模3D空间数据集仍然需要耗费大量时间和成本，因此需要结合2D切片来提高统计效力并增强所识别转化相关特征的可靠性。我们利用先进的水清组织和光片显微镜技术，实现了对直径约为10毫米3的完整乳腺和前列腺肿瘤组织的原生3D观测。发现跨越毫米级距离的相互连接区域，进一步突显了3D分析在理解肿瘤拓扑结构和空间关系方面的优势，而这些是2D成像无法捕捉到的。通过使用CK5和PanCK对肿瘤样本进行染色，我们清晰地区分了癌前病变、侵袭性癌变区域和相邻的正常结构，发现这两种癌症中的侵袭性癌变区域形成了相互连接的树状肿瘤结构，尽管在2D切片中它们看起来是分离和分散的。我们的原生3D成像方法可以直接观察肿瘤间和肿瘤内的异质性，以及癌细胞与TME成分之间的相互作用。通过3D连续切片技术追踪特定区域，我们能够沿着与空间组学数据平面相交的连续结构追踪肿瘤的转化过程，这是2D切片方法无法实现的。我们确定了多个在z轴上具有转化区域的3D研究区域。例如，我们跟踪了前列腺腺体从正常状态到高级别导管内乳头状增生（HGPIN），再到高级别导管内癌（GP3）的形态变化，以及乳腺DCIS区域通过微浸润（MI）逐渐转变为完全侵袭性细胞的过程。由于我们在关键位置使用了不同的空间平台，因此能够利用多种高维分子特征来追踪这些转化过程，并对其进行交叉验证。通过我们的综合基因发现方法，我们强调了推动从正常上皮细胞向侵袭性上皮细胞转变的多个关键且多样的机制，其中大多数机制涉及四个生物学过程：组织完整性/ECM重塑、细胞间通信、代谢/稳态以及增殖和存活（图6B）。越来越多的证据表明，在乳腺癌背景下，微钙化可能具有促侵袭性（71, 72）。我们发现了MGP这种基因，它之前在DCIS到IDC的转化过程中未被关注，其主要功能是通过直接结合Ca2+以及阻止BMP2信号向下传递来防止钙沉积（73–75）。同时，BMP2已被证明在乳腺癌模型中能诱导EMT并促进转移（76），这解释了为什么抑制其信号传导可能对侵袭性癌症有利。我们还发现PLAT在前列腺和乳腺的转化过程中都起着重要作用，并与组织重塑相关。此外，我们发现了在乳腺和前列腺侵袭性细胞中表达模式不同的基因，如ANPEP和ALDH1A3（在前列腺中过表达，在乳腺中低表达）。另外，我们发现了一些在两种癌症中都表达共同的标志物，如FASN和EPHA6，这些标志物在侵袭性区域中均过度表达。尽管许多与转化相关的基因在乳腺和前列腺癌症中有所不同，反映了组织特异性，但它们所影响的生物学过程的共性可能表明了具有腺泡腔细胞起源的癌症发生和进展所需的关键事件。DCIS和PIN都是癌前病变，它们被困在导管网络内，基底细胞、基底膜和周围的基质成分限制了它们的移动。乳腺和前列腺腔内细胞的增殖/存活变化以及代谢变化对于肿瘤的内在转化至关重要，而涉及组织完整性/ECM重塑和细胞间通信的基因变化对于细胞向更具侵袭性的类型（IDC和PCa）的进展也至关重要。值得注意的是，参与这些转化的许多基因，特别是那些在前列腺和乳腺癌中共有的基因，受到激素调节，包括MYC、GDF15和FASN。雌激素在乳腺癌中直接上调MYC的表达（77），而在前列腺癌中，雄激素信号可以增加MYC的表达（78）。同样，雌激素和雄激素都调节FASN的表达（79, 80）。此外，这些基因的部分产物也可以调节激素信号传导（81）。此外，一些仅在癌症中发现的基因也受到激素的调控。例如，雄激素会在前列腺癌细胞中上调ALDH1A3的表达（82）。这些基因的激素调控机制以及它们对肿瘤转变过程中激素信号传导的潜在相互作用仍有待阐明。此外，我们对肿瘤微环境（TME）的分析强调了肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）和癌相关间质细胞（CAFs）在侵袭性转变中的动态贡献。SPP1+和MS4A6A+ TAMs的空间分离表明，这些巨噬细胞群体可能根据肿瘤亚型不同而以不同的方式促进肿瘤进展。虽然SPP1+ TAMs普遍被认为具有促进肿瘤生长和抑制免疫的功能（83–85），但我们的数据表明，它们在非三阴性乳腺癌（TNBC）的侵袭性前沿有特定的促进作用，而在TNBC乳腺癌或前列腺肿瘤中则没有这种作用。相比之下，MS4A6A+ TAMs之前在胶质瘤和乳腺癌中被发现（84, 86, 87），它们与非侵袭性区域相关，表明它们可能减缓侵袭性转变。总之，这些发现支持上皮细胞侵袭不仅由肿瘤内在程序驱动，还受到特定TAMs和CAFs群体的影响。由于识别哪些病例会发展成恶性肿瘤以及何时应开始医疗和/或手术治疗的紧迫性，精确定义癌前状态的挑战现在变得尤为突出（88）。尽管现在可以检测到诸如体细胞突变和表观遗传修饰这样的变化，但这些信息本身还不足以作为启动临床干预的充分依据。这里开发的方法和后续发现应该有助于通过进一步完善癌症相关通路和基因的空间特征、典型的组织重塑模式以及来自ECM和TME的信号，来更好地定义不同类型癌症的癌前状态。区分从正常到恶性转变过程中的各个步骤，并将这些知识转化为临床实践，应该能够显著改善早期干预方案，因为这仍被认为是能为患者提供最大医疗益处的方法（89）。

**样本收集与处理**

所有样本都是在圣路易斯华盛顿大学医学院获得患者的书面知情同意后收集的[机构审查委员会（IRB）协议201108117]。所有研究均遵循公认的伦理准则，包括赫尔辛基宣言、CIOMS指南和美国通用规则，并获得了IRB的批准。肿瘤鉴定后，每个样本被分成多个部分，再进一步切成四块横向切片。这四块切片分别放入福尔马林、液氮快速冷冻和DMEM中快速冷冻，然后固定在最佳切割温度（OCT）下。相关协议可以在protocols.io上找到（https://doi.org/10.17504/protocols.io.bszynf7w）。

**Visium库制备与测序**

Visium切片是按照之前报道的协议制作的（90–92）。具体来说，对于OCT固定的样本，Zhou及其同事描述了详细的方法（91），而对于福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）的样本，Wu及其同事描述了方法（92）。简而言之，OCT固定的组织或FFPE组织样本按照Visium空间基因表达切片指南进行切片。对于OCT固定的样本，新鲜组织样本首先用室温下的OCT处理后切片（10 μm）。切片随后用甲醇固定，用H&E染色，并在Leica DMi8显微镜上使用明场成像设置观察（20倍放大）。组织样本然后通透化18分钟，按照Visium空间基因表达试剂盒用户指南CG000239（10x Genomics）构建ST库。对于FFPE组织，使用Visium组织切片测试切片进行质量评估，并按照Visium空间基因表达FFPE–组织准备指南CG000408（10x Genomics）进行RNA质量检查。切片经过评分并切割，以适应Visium空间基因表达切片的捕获区域。脱蜡、H&E染色和解交联按照CG000409（10x Genomics）进行。ST库按照Visium空间基因表达FFPE用户指南CG000407（10x Genomics）构建。库在Illumina NovaSeq-6000系统的S4流式细胞仪上进行测序。有关使用10x Genomics Visium的FFPE ST和OCT ST的相关协议可以在protocols.io上找到（dx.doi.org/10.17504/protocols.io.kxygx95ezg8j/v1和dx.doi.org/10.17504/protocols.io.x54v9d3opg3e/v1）。

**Visium数据处理**

对于每个样本，我们通过将解复用的FASTQ文件和相关的H&E图像传递给Space Ranger（v.1.3.0、v.2.0.0和v2.1.0的“count”命令，使用默认参数并启用重新定向图像功能），以及预构建的GRCh38基因组参考2020-A（GRCh38和Ensembl 98），获得了每个样本的未过滤特征-条形码矩阵。

**Visium HD库制备与测序**

FFPE组织样本按照Visium HD FFPE组织准备指南CG000684（10x Genomics）进行切片并放置在标准的带电玻璃 slide 上。杂交和连接后，探针从5-μm的切片中释放出来，并使用Visium CytAssist仪器（10x Genomics, 1000499）捕获在Visium HD Slide（10x Genomics, 1000670）上。后续的库处理遵循Visium HD空间基因表达试剂用户指南CG000685（10x Genomics）。条形码库在Illumina NovaSeq 6000系统上使用相关流式细胞仪进行测序，目标运行大小至少为250 mol/L读取对。

**Xenium数据生成**

FFPE样本块以5 μm的厚度切片，并按照修改版的FFPE组织准备指南（10x Genomics, CG000578, Rev B）放置在Xenium slide 上。切片首先通过一系列的二甲苯和乙醇洗涤进行脱蜡，然后使用FFPE组织增强剂进行解交联（10x Genomics, CG000580, Rev B）。接下来进行过夜的原位探针杂交，使用Human Multi-Tissue and Cancer Panel（10x Genomics, 1000626）对377个基因进行杂交。选定的样本还额外接受了100个基因的定制探针组（补充表S5）。探针随后连接并进行滚环扩增。使用自荧光混合物淬灭背景。用DAPI染色细胞核，以改善仪器内的样本跟踪和细胞边界分割（10x Genomics, CG000582, Rev D）。样本随后按照制造商的说明加载到10X Xenium Analyzer仪器（10x Genomics, 1000481）上进行成像和初步数据处理（10x Genomics, CG000584, Rev C）。Xenium切片后的H&E染色按照提供的指南进行（10X Genomics, CG000613, rev B）。有关10x Genomics Xenium for FFPE的用户指南可以在protocols.io上找到（dx.doi.org/10.17504/protocols.io.81wgbxjonlpk/v1）。

**CosMx样本制备与数据生成**

CosMx SMI分析分别在乳腺和前列腺肿瘤FFPE块HT704B1-S1H3Fp1和HT891Z1-S2H3Fp1上进行，使用CosMx 1K和6K Discovery Panel。FFPE块以5 μm的厚度切片并放置在VWR Superfrost Plus Micro slide 上。切片首先通过几次二甲苯和乙醇洗涤进行脱蜡，然后在100°C下使用1× Target Retrieval Solution进行热诱导的目标回收，时间为15分钟。组织切片在杂交室中用5 μg/mL Proteinase K在40°C下孵育30分钟。切片用1× PBS洗涤两次，并在室温下用0.0004% fiducials稀释在2× SSC中的混合液浸泡5分钟。多余的fiducials用1× PBS从切片上冲洗掉，然后用10%中性缓冲福尔马林（NBF）在室温下固定1分钟。固定后的样本用Stop Buffer冲洗两次，该缓冲液由0.1 mol/L甘氨酸和0.1 mol/L Tris-base在DEPC H2O中组成，再用1× PBS冲洗一次，每次1分钟，之后用100 mmol/L NHS acetate在CosMX NHS acetate buffer中封闭15分钟。切片随后用2× SSC冲洗5分钟，并在杂交室中用杂交溶液（Denatured CosMx RNA Probe mixes）孵育18小时。18小时后，用严格溶液（50% formamide在2× SSC中）和2× SSC缓冲液冲洗以去除多余的探针。在杂交室中用细胞分割混合物（CD292/B2M）、标记混合物（PanCK/CD45）和定制混合物（CD68）对细胞核进行染色1小时，然后在室温下用1× PBS和2× SSC冲洗三次。流式细胞仪带有唯一的条形码，按照CosMx SMI仪器用户手册中的说明（Man-10161-02-1）将切片加载到CosMx SMI上。原始数据和flatfiles从AtoMx平台下载下来，以便进一步分析。

**3D光片组织的清除、染色和成像**

组织通过WU Solid Tumor Tissue Bank获得，来自手术患者，并在主治病理学家的协助下获得了书面知情同意。每个组织块通过拍照、称重和记录解剖标志物来记录，然后进一步分成4到6个较小的组织块。每个较小的块再分成大约6 mm × 6 mm × 2 mm的三块，按照以下步骤处理：1）用10% NBF进行组织学表征，例如H&E和CODEX染色；2）在液氮中快速冷冻或嵌入OCT进行基因组分析；3）用4% paraformaldehyde固定用于光片分析。指定用于光片的块在24小时后用PBS冲洗，然后准备好进行组织清除。组织清除时，样本首先用SHIELD polyepoxy（93）渗透6天，同时在4°C下恒温搅拌，然后在37°C下聚合24小时，接着使用SmartBatch+ ETC active tissue clearing平台（LifeCanvas Technologies）进行脱脂。样本在室温下用1× PBS洗涤24小时，然后进行抗体染色，并用含有0.2% Triton X-100的1× PBS渗透两次，每次1小时，之后进行封闭。样品在37°C下用含有0.2% Triton X-100和10% DMSO的PBS封闭6%。封闭处理后，样品在含有0.2% Tween-20和10 μg/mL肝素的PBS中洗涤两次，温度为37°C，然后在37°C下与荧光标记的抗体孵育4天。所使用的抗体包括AF488标记的抗CK5（AB_2893023）和AF594标记的抗PanCK（AB_3741555）。所有抗体均在含有0.2% Tween-20、5% DMSO、3%驴血清和10 μg/mL肝素的PBS中稀释至1:200的比例。第3天时，以1:10,000的比例向溶液中加入Hoechst。染色完成后，样品用PBS/0.2% Tween-20/10 μg/mL肝素洗涤至少5次，每1小时更换一次洗涤液。染色后，使用EasyIndex RI匹配介质（LifeCanvas Technologies）将样品的折射率调整至1.52。整体样本图像使用Miltenyi Ultra Microscope Blaze Gaussian lightsheet平台和4×/0.35 MI PLAN物镜进行采集。数据集使用Stitchy（Translucence Biosystems）软件拼接，并通过Bitplane Imaris 10.1.1（Oxford Instruments）软件进行可视化处理。lightsheet显微镜的横向分辨率可计算为发射波长除以数值孔径的两倍，CK5通道的分辨率为0.741 μm，PanCK通道的分辨率为0.881 μm。由于感兴趣的结构不需要达到理论分辨率极限，因此我们采用了1.62 μm的横向采样间隔。FLSM系统的轴向分辨率由光片的厚度（7 μm）决定，并在Nyquist频率下进行采样。

**CODEX制备和成像**

无载体单克隆或多克隆抗人抗体可从Supplementary Table S4中购买，并通过多通道IF染色进行验证。筛选后，使用Akoya Antibody Conjugation Kit（Akoya Biosciences，SKU 7000009）根据IF染色结果分配特定的条形码（Akoya Biosciences）对抗体进行标记。一些常用标记物直接从Akoya Biosciences购买。Keyence协议：CODEX染色和成像按照制造商的说明书（CODEX User Manual - Rev C）进行。具体步骤如下：将5 μm厚的FFPE切片放置在涂有APTES（Sigma，#440140）的盖玻片上，在60°C下烘烤过夜后进行脱蜡。次日，将组织浸泡在二甲苯中，再用乙醇重新水化，随后在煮锅中用pH值为9的TE缓冲液（Genemed，#10-0046）进行抗原提取，时间约为10分钟。接着使用CODEX染色试剂盒（SKU 7000008）的封闭缓冲液对组织进行封闭处理，然后在潮湿环境下室温下用标记抗体孵育3小时。CODEX多循环实验的成像使用Keyence荧光显微镜（型号BZ-X810）进行，配备Nikon CFI Plan Apo λ 20x/0.75物镜、CODEX仪器（Akoya Biosciences）和CODEX Instrument Manager（CIM；Akoya Biosciences）。原始图像使用CODEX处理器（Akoya Biosciences）进行拼接和处理。多重成像完成后，对同一组织进行H&E染色。每个CODEX切片的相应信息列在Supplementary Table S4中。

**PhenoCycler协议：**免疫染色过程按照PhenoCycler-Fusion样品试剂盒（Akoya，cat. #7000017）和用户指南进行。选定的FFPE切片切割成5 μm厚，放置在Fisherbrand（cat. #1255015）的带电载玻片上，并在42°C的热块上干燥。脱蜡前，将载玻片在65°C下烘烤过夜。脱蜡过程包括两次二甲苯处理，随后依次用不同浓度的乙醇（100%、90%、70%、50%和30%）和Milli-Q水（ddH2O）进行水化。前列腺癌组织的抗原提取在1× Tris-EDTA（pH 9）中用煮锅处理18分钟，乳腺癌组织则处理20分钟。样品切片在润湿缓冲液中洗涤两次后，放入染色缓冲液中平衡30分钟。随后，在潮湿环境下室温下用含有N Blocker、G Blocker、J Blocker和S Blocker的染色缓冲液（200 μL）中的所有抗体孵育3小时。染色后，切片在染色缓冲液中洗涤两次，然后用1.6%的戊二醛在储存缓冲液中固定10分钟。接着用PBS洗涤三次，再在冰冷的甲醇中洗涤5分钟，然后用PBS洗涤三次并放入最终固定液中孵育20分钟。 reporter蛋白根据PhenoCycler-Fusion用户指南制备，并分配到96孔黑板上。PhenoCycler-Fusion实验的模板使用PhenoCycler Experiment Designer软件设计。每个CODEX运行使用的抗体详细信息见表S4。实验使用Akoya的Fusion 1.0.8软件执行，最终图像在PhenoImager Fusion显微镜上生成。

**3D连续切片程序：**

FFPE标本块在冰上冷却至少20分钟后进行切片，切片厚度为5 μm，以确保覆盖样本的整个表面，并持续切片直到包含感兴趣的区域。达到最佳表面暴露和切片质量后，连续切割组织条带，直到组织用尽或获得所需的切片数量。切片过程中按顺序标记为U1、U2、U3等。切片完成后，将条带轻轻放置在不干净的表面上，并分成每条含有8到10个切片的较小条带。这些较小的条带缓慢转移到水浴中，确保其平整地漂浮而不会折叠或断裂。任何在切片前折叠或断裂的切片都会被丢弃，但会保留其切片编号。切片按计划顺序逐一转移到普通玻璃载玻片、Visium载玻片或Xenium载玻片上。随后根据空间平台的特定协议对切片进行处理。每个样品的切片保留情况详见Supplementary Table S7。

**3D连续切片配准：**

配准前，成像数据先转换为核强度通道的灰度图像。然后图像缩小5倍以进行关键点选择。对于Visium和Visium HD，使用同样缩小5倍的H&E图像进行关键点选择。配准过程中，我们使用了BigWarp工具（arXiv:1511.01154），该工具内置于Fiji/ImageJ软件应用程序中。配准时，以第一个连续切片作为固定图像，第二个切片作为移动图像。将第二个切片变形为第一个切片后，用第二个切片作为第三个切片的固定图像进行变换。所有连续切片实验的图像都以此方式进行处理，每个图像变换选择4到10个关键点。关键点选定后，从BigWarp导出每个图像变换的移动场（thin plate spline）。这个密集的位移场（DDF）随后放大5倍，以便用于变形全分辨率图像数据。DDF还用于配准相应的基于点的数据（CosMx和Xenium的转录本位置、Visium的点位以及Visium HD的网格位置）。配准所用代码可在https://github.com/ding-lab/mushroom/blob/main/README.md#manuscript-materials获取。

**乳腺3D连通性分析：**

我们通过三部分流程使用Xenium、CODEX和H&E切片构建了3D区域体积，以分析连续切片乳腺癌病例（HT704B1、HT206B1和HT397B1）的连通性：(i) 从H&E切片预测蛋白质丰度，(ii) 自动标注上皮区域，(iii) 重建互连区域。由于Xenium和CODEX切片之间存在间隙，我们决定使用H&E切片填补这些间隙。由于H&E切片中没有上皮细胞的天然标记物，我们训练了一个深度学习模型，利用H&E数据进行标记物丰度预测。为了实现跨连续切片的上皮连通性体积重建，我们使用深度学习模型估算中间H&E切片中的上皮标记物丰度。该模型专门用于上皮区域分割，以支持3D连通性分析。训练时，我们使用相邻的CODEX和H&E切片为每个连续切片案例分别训练模型。推理时，模型输入的是H&E切片，输出是某些CODEX标记物的蛋白质丰度（见Supplementary Table S8）。模型架构、训练方法和推理流程详见下文。架构和训练参数见Supplementary Table S8。我们使用U-net（arXiv:1505.04597）作为基础模型，结合ResNet-18（arXiv:1512.03385，arXiv:2110.00476）作为架构，再加上由2D卷积组成的预测头进行蛋白质丰度预测。我们为每个案例训练单独的模型。训练时选择相邻的CODEX和H&E切片。图像预处理步骤如下：首先对H&E和CODEX图像的每个通道进行归一化处理。这些图像原始大小过大，无法直接输入模型，因此需要分割成256 × 256像素的块。但在分割过程中，我们移除了块外可能影响蛋白质丰度预测的形态学信息。为每个块添加额外的区域信息是一种解决方法（94）。为了赋予每个块其周围环境的形态学背景，我们还并行训练了额外的Unet，输入图像为放大的低分辨率（2×、4×、8×和16×）视图。每个Unet处理后的激活结果被拼接后输入预测头。通过这种方式，我们为每个高分辨率块提供了有助于蛋白质预测的形态学背景。模型使用Pytorch Python库（arXiv:1912.01703）实现。训练过程中，我们从2D切片中随机选择图像块，每个块以50%的概率进行水平或垂直翻转。大多数连续H&E切片在同一批次中成像，以减少批次效应。因此，我们对输入图像块没有进行其他颜色增强处理。Unet和预测头处理后，得到一个C × W × H的张量，其中高度和宽度与输入图像块相同，c表示预测的CODEX蛋白质数量。模型损失采用预测值与真实蛋白质丰度之间的均方误差（MSE）进行评估，其中真实值是指H&E切片旁边CODEX切片中的蛋白质丰度。每个模型训练640,000步，批量大小为64。训练完成后，我们对所有H&E连续切片进行模型推理，生成每个H&E切片的蛋白质丰度值。接着利用上皮标记基因的表达情况自动化识别上皮区域（包括正常组织、DCIS和IDC形态）。首先根据Xenium或CODEX面板中的基因和蛋白质选择上皮标记基因。将所有输入切片分割成15 μm的分辨率。分割Xenium数据时，将Xenium切片覆盖的区域划分为15-μm的网格方格，并汇总每个网格方格内所有细胞的表达计数。对于CODEX和H&E切片，我们将图像重新调整为15 μm的分辨率。选择15-μm的分辨率是因为主要目标是实现区域级别的小腺上皮分割。由于存在轻微的配准不确定性和偶尔丢失的连续切片，体积连续性主要受z轴采样密度的影响，而非平面分辨率。15-μm的分辨率在保持上皮分割准确性和交叉间隔一致性之间取得了平衡。通过手动检查为每个标记物定义了一个截止值，然后以此值分割上皮区域。然后应用了一种二值孔填充算法来填补区域中的孔洞，为此我们使用了scipy Python包中的scipy.ndimage.binary_fill_holes函数（arXiv:1907.10121）。通过构建一个N × H × W数组来识别相互连接的上皮细胞像素区域，其中N是一个病例中Xenium、CODEX和H&E切片的总数。每个体素要么是阳性（上皮细胞），要么是阴性（非上皮细胞）。相邻的上皮细胞体素被视为相互连接的。我们使用了scikit-image Python包中的skimage.morphology.label函数来识别这些相互连接的3D区域。

我们使用手动区域注释来标记相互连接的上皮区域，以便进行连接性分析和3D感兴趣区域（ROI）路径的构建。首先，我们为每个感兴趣的区域生成一个OME-TIFF文件。OME-TIFF文件存储代表每个系列切片的伪彩色图像堆栈。然后使用QuPath（96）图像查看平台来查看OME-TIFF文件。在QuPath中手动标注上皮区域。标注后的区域坐标以GeoJSON格式（https://datatracker.ietf.org/doc/html/rfc7946）导出，以便后续的可视化和分析。

ROI的选择是基于区域形态的。使用Imaris 3D图像查看平台来搜索相互连接的形态。按照上面手动注释部分的描述，为每个系列切片生成伪彩色图像，然后将这些图像转换为+.ims文件。之后，我们能够查看每个伪彩色图像，以识别正在经历非侵袭性到侵袭性转变的上皮区域（前列腺中的正常、HGPIN和GP3；乳腺癌中的DCIS、MI和IDC）。然后使用“手动标注相互连接的上皮区域”的方法对这些转变区域进行标注（补充表S9和S10）。

我们选择了具有非侵袭性到侵袭性相互连接形态的ROI。对每个相互连接的结构的2D截面进行分割，以便追踪进展状态之间的连续性和转变，从而更详细地了解单一结构内的空间和分子动态。使用传统的非系列2D图像切片无法进行这种分析。为了识别在IDC与DCIS之间差异表达的基因，我们利用了2D和3D的ST数据集（Xenium、CosMx、Visium和Visium HD）。对于2D队列级别的基因发现，我们在ST切片上使用了自动化和手动标注方法。在Xenium、CosMx和Visium HD切片中进行了自动化差异基因表达发现。这包括识别上皮区域并使用基底层标记来评估肌上皮强度，然后将其与基因表达相关联（见“2D自动化基因发现”），从而识别与肌上皮完整性相关的基因（补充表S11）。为了补充自动化方法，我们还实施了一个手动工作流程，在Visium切片中随机手动选择了DCIS（n = 5+）和IDC（n = 5+）形态的区域（补充表S12；见“2D手动基因发现”）。随后基于这些手动标注进行了DEG识别。对于3D ROI级别的基因发现，我们识别了特定于3D ROI的DEGs，以表征单个相互连接上皮结构内进展状态的基因表达变化（补充表S13和S14）。对于3D基因发现，我们使用了两种方法：基于形态的和基于路径的（见“3D基因发现”）。简要来说，对于基于形态的方法，我们标注了区域（乳腺癌中的DCIS、MI或IDC；前列腺中的正常、HGPIN或GP3），并使用Student t检验和倍数变化来量化组间的表达差异。在基于路径的发现中，我们对每个上皮结构转变路径上的表达值进行了回归分析。这种双层方法提供了基因表达景观的全面视图，揭示了与侵袭性转变相关的关键分子途径和生物学过程。手动策划和视觉检查进一步细化了与乳腺癌进展相关的特定于管腔上皮细胞的基因的识别。

我们使用了手动和自动化方法来进行2D DEG发现。对于自动化发现，我们首先在Xenium、CosMx和Visium HD切片中标注了具有侵袭性和非侵袭性形态的上皮区域。对于Xenium和CosMx，该过程首先将所有输入切片调整为相同的分辨率：每个像素10 μm。然后我们以自动化的方式识别上皮区域。首先，所有切片都在基因水平上进行了标准差归一化。然后通过阈值处理每个网格中EPCAM大于1.0的图像来构建上皮掩码。接着使用孔填充算法填充由于转录本稀疏性和坏死而产生的空隙。所有正的网格（即像素）都被视为上皮像素。然后我们使用scikit-image Python包中的skimage.morphology.label函数来识别连接的像素区域。连接像素的面积小于10的被过滤掉。这些剩余的像素区域被视为上皮区域。对于Visium HD，我们根据可用数据采用了两种标注方法。对于包含在3D堆叠系列切片数据集中的切片，我们使用“Breast 3D Connectivity Analysis”中的U-net模型的输出作为上皮“表达”。然后我们以与前一节相同的方式生成上皮掩码。对于不是3D堆叠数据集部分的Visium HD切片，我们执行了与Xenium和CosMx相同的程序，但有以下更改：归一化后的表达图像进行了高斯模糊（alpha = 5），并且EPCAM的阈值设为0.1。表达图像进行高斯模糊以考虑由于使用2-μm Visium HD方格镶嵌而引入的额外稀疏性。在识别区域后，我们量化了区域的三个区域的特征表达：区域本身（即管腔细胞）、区域边界（即基底层）和区域周围的区域（即TME）。生成掩码来识别属于每个区域的像素，并以以下方式定义。“区域”掩码与之前描述的上皮掩码相同，但缩小了10 μm。“边界”掩码是通过上皮掩码与扩展了20 μm的上皮掩码之间的区域定义的。“TME”掩码是通过将上皮区域扩展40 μm并减去“边界”和“区域”掩码来定义的。区域面积掩码不允许扩展到另一个区域的区域。使用scikit-image（95）Python包中的skimage.segmentation-expand_labels函数来扩展上皮区域。然后量化了每个区域、边界和TME掩码的表达。有了表达值后，我们能够将区域内的特征表达（“区域”掩码）与基底层标记的边界（“边界”掩码）表达相关联。一个特征在切片中的正相关值表明该区域内的基因表达与区域边界中基底层标记的更高表达相关（即基因表达与基底细胞层更完整的区域相关）。负相关表示相反的关联。同样的指标也用于区域外的区域（“TME”掩码），以识别与区域基底层表达相关的TME基因。我们将TME定义为从上皮边界向外延伸100 μm的肿瘤周围区域。这个距离捕捉了肿瘤上皮生物学相关范围内的基质和免疫细胞，与定义细胞邻域的空间肿瘤学研究一致（97–99）。100-μm的边界既包括了直接的侵袭性微环境，又最小化了对上皮转变不太可能有直接影响的远距离基质区域的纳入。由于不同空间平台之间的标记缺失，无法在每个切片中使用相同的基底层标记。一个切片的基底层标记是通过从以下标记列表中选择一个基因来确定的：（KRT5、KRT14、KRT15、LAMB3和ACTA2）。对于每个样本，我们遍历标记列表，一旦找到一个基底标记基因，就使用该基因作为该样本的标记基因。此外，对于原发肿瘤为基地型的TNBC病例，我们使用ACTA2作为基底层标记。补充表S11包含了这项分析的相关值。

我们还对Visium切片进行了手动注释，其中表达的分辨率有限，不适合使用2D自动化基因发现中的技术。为此，我们实现了一个手动工作流程，其中随机手动标注了至少五个正常、DCIS和IDC在乳腺中的区域——或正常、HGPIN和GP3+在前列腺中的区域——的形态。然后计算每个区域的平均特征表达，并使用Student t检验来量化不同形态之间的差异。注释的条形码（补充表S12）和比较统计信息（补充表S11）可以在补充材料中找到。

我们通过多平台、3D系列切片DEG发现进一步加强了我们的基因发现方法。通过这种方法，我们能够量化单个区域在从非侵袭性到侵袭性形态转变过程中的基因表达变化。为此，我们使用了两种方法：基于形态组别和基于路径的比较。对于这两种方法，我们都使用了在“手动标注相互连接的上皮区域”中描述的区域。表达和关联值分别可以在补充表S13和S14中找到。对于基于形态组别的发现，我们根据形态对区域进行了标注（乳腺癌中的DCIS、MI或IDC；前列腺中的正常、HGPIN或GP3），并计算了每个区域的平均基因表达。然后，根据数据类型的具体情况，我们使用Student t检验和倍数变化来量化形态组之间的差异。由于区域转变的速度和位置不同，同一个空间平台并不总是能够捕捉到每个相互连接区域的每个形态状态。倍数变化计算公式为[(b + 1) ? (a + 1)]/(a + 1)，其中a和b是与不同形态组相关的表达值数组。对于基于路径的发现，我们对每个相互连接区域的多个空间平台上的表达值进行了Z值缩放。然后对每个Xenium、CosMx和Visium HD切片的缩放表达值进行了线性回归分析。值按照从相互连接区域的最不侵袭端到最侵袭端的顺序排列。因此，正相关表示向侵袭性端表达增加，而负值则表示相反的情况，即在该区域的较少侵袭性区域表达增加。

对于样本HT704B1的六个Xenium切片，我们进行了3D邻近性分析，以评估巨噬细胞和上皮区域之间的空间关系。首先，将TAMs分为两个群体：SPP1+ TAMs和MS4A6A+ TAMs。细胞注释是基于以下标准的转录本检测：如果一个细胞包含至少一种巨噬细胞标记物（CD68、CD163、CSF1R或CD14）的转录本，至少一种SPP1的转录本，且没有EPCAM转录本，则将其分类为SPP1+ TAM。同样，如果一个细胞包含至少一种巨噬细胞标记物（CD68、CD163、CSF1R或CD14）的转录本，至少一种MS4A6A的转录本，且没有EPCAM转录本，则将其分类为MS4A6A+ TAM。接下来，我们使用所有切片中的空间坐标计算了每个TAM到最近上皮区域的最短3D距离。对于每个上皮区域，我们计算了基底层强度得分，定义为“2D自动化基因发现”中的“方法”部分描述的基底层边界标记的z-scored转录本计数。较高的基底层强度得分对应于基底层完整性较强的区域，这与侵袭性较低的DCIS形态一致，而较低的得分则表明基底层完整性较低，这是更具侵袭性的IDC区域的特点。这种方法为每个TAM分配了其最近上皮区域的基底层强度得分，提供了其所在上皮环境侵袭性的定量测量。

免疫染色按照描述的方法进行（100）。FFPE块切成5 μm厚度，并放置在Superfrost Plus载玻片上，在60°C下烘烤过夜，然后进行脱蜡。第二天，组织样本在二甲苯中脱蜡后在乙醇中重新水化，并用无离子水（ddH2O）洗涤，接着使用0.1 mmol/L Tris-EDTA缓冲液（pH值9，产品编号#NB900-62085，Novus）在蒸汽条件下进行热诱导抗原修复，时间为10分钟。这些切片与100 mmol/L甘氨酸孵育2×10分钟，随后在室温下与封闭液（5%灭活的正常驴血清和10 mg/mL BSA）孵育1小时。之后，切片在湿润环境中与一级抗体在4°C下过夜孵育。再用PBST洗涤3次，每次5分钟，之后与二级抗体在室温下孵育1小时，再洗涤4次，每次5分钟。用Hoechst染色5分钟后，切片再次用PBST洗涤5分钟，然后用VectaMount AQ水基封片剂（产品编号#H-5501-60，Southern Biotech）进行封片。使用的一级抗体包括：Abcam公司的兔单克隆抗ANPEP（AB_10866195；稀释度1:100）、兔多克隆抗ALDH1A3（AB_2937054；稀释度1:100）、兔多克隆抗FASN（AB_732316；稀释度1:100）和兔单克隆抗GDF15（AB_3099455；稀释度1:100）；LSBio公司的兔多克隆抗EPHA6（AB_3741541；稀释度1:100）；Life Technologies公司的鼠单克隆抗PanCK（AB_10942225；稀释度1:200）和抗CK5（AB_2538529；稀释度1:200），以及Alexa Fluor 488、594和647标记的二级抗体（稀释度1:1000）；R&D Biosytems公司的山羊多克隆抗E-钙粘蛋白（AB_355568；稀释度1:100）。荧光图像是用Keyence荧光显微镜（BZ-X810；Keyence）获得的。正常组织、癌前病变组织和癌组织区域通过Napari软件进行了标注，并计算了每个区域的平均荧光强度。

人类乳腺癌和前列腺癌细胞系ETCC-006（CVCL_6G19）、ETCC-010（CVCL_6G22）和PC3（CVCL_E2RM）由美国典型培养物集合中心（ATCC）提供（2022年3月）。作者收到细胞系后未对其进行额外的分析。细胞解冻后用于实验，且在培养过程中不超过2个月。细胞定期使用MycoAlert霉菌检测试剂盒（Lonza公司，产品编号#LT07-318）进行支原体污染检测，最近一次检测是在2025年8月，结果为阴性。细胞在含有10%胎牛血清（Gibco公司，产品编号#16140071）和1%青霉素-链霉素（Gibco公司，产品编号#15140122）的RPMI-1640培养基（Gibco公司，产品编号#11875093）中培养，并在含有5%二氧化碳的湿润培养箱中维持在37°C。对于前列腺癌实验，我们最初筛选了四种常用的前列腺癌细胞系，检测它们是否表达目标基因（GDF15、FASN、ALDH1A3和ANPEP）。在这四种细胞系中，只有PC3细胞同时表达了所有四个基因，因此被选为后续的功能研究（见补充图S11）。为了下调目标基因的表达（乳腺癌细胞中的MGP和PLAT基因，以及前列腺癌细胞中的GDF15、ANPEP、ALDH1A3和FASN基因），我们从Sigma公司购买了编码特定shRNA的慢病毒颗粒及对照shRNA，这些慢病毒颗粒基于pLKO.1载体。细胞接种在六孔板中，在10 μg/mL polybrene（Sigma-Aldrich公司，产品编号#TR-1003-G）的存在下进行慢病毒转导。48小时后，用10 μg/mL puromycin（Sigma-Aldrich公司，产品编号#P8833）筛选细胞7天，以建立稳定的下调细胞系。存活下来的细胞经过扩增后用于后续实验，培养不超过五代。下调效率通过RT-qPCR验证。MGP和PLAT的shRNA靶序列分别为GCGGTAGTAACTTTGTGTTAT和CAAGGTTTACACAGCACAGAA；GDF15、FASN、ALDH1A3和ANPEP的shRNA靶序列分别为CCGGATACTCACGCCAGAAGT、CATGGAGCGTATCTGTGAGAA、GCTGTATTAGAACCCTCAGAT和ACCCAGTACAGCGAGGTTAATG。细胞系的总RNA根据制造商的说明书使用RNA提取试剂盒（Invitrogen）提取。RNA的浓度和纯度通过NanoDrop分光光度计测定。一微克的总RNA使用cDNA合成试剂盒（Thermo Fisher Scientific公司，产品编号#4374966）进行反转录。qPCR使用SYBR Green Master Mix（BIO-RAD公司，产品编号#1725121）在QuantStudio或ABI 7500系统上进行。相对基因表达通过2^-ΔΔCt方法计算，以ACTB和GAPDH作为内参。MGP的引物序列为TCCGAGAACGCTCTAAGCCT；GCAAAGTCTGTAGTCATCACAGG。PLAT的引物序列为AGCGAGCCAAGGTGTTTCAA；CTTCCCAGCAAATCCTTCGGG。ACTB的引物序列为CATGTACGTTGCTATCCAGGC；CTTCTTAATGTCACGCACGAT。GAPDH的引物序列来自Integrated DNA Technologies公司（参考编号#580480971和#580480972）。FASN的引物序列为TTCTACGGCTCCACGCTCTTCC；GAAGAGTCTTCGTCAGCCAGGA，GDF15的引物序列为GTTAGCCAAAGACTGCCACTG；CCTTGAGCCCATTCCACA。ALDH1A3的引物序列为TGGATCAACTGCTACAACGC；CACTTCTGTGTATTCGGCCA。ANPEP的引物序列为GACCAAAGTAAAGCGTGGAATCG；TCTCAGCGTCACCCGGTAG。细胞增殖通过Cell Counting Kit-8（CCK-8；Dojindo公司）进行检测。每个孔中接种2,000至4,000个细胞，重复三次。在指定时间点（如0小时、24小时、48小时、72小时、96小时和120小时），向每个孔中加入10 μL CCK-8溶液，37°C下孵育2小时。使用微孔读数器（BioTek或Thermo）测量450纳米处的吸光度。正常对照组、MGP-KD（下调组）、PLAT-KD、GDF15-KD、FASN-KD、ALDH1A3-KD和ANPEP-KD细胞分别接种在六孔板中，培养至大约100%汇合。使用无菌200-μL移液器尖端在细胞单层上划一条直线。用PBS洗涤去除脱落的细胞，并补充新鲜的无血清培养基。图像在0小时和24小时后使用光学显微镜（放大倍数为×5）拍摄。使用ImageJ软件测量伤口面积，并将迁移率量化为伤口闭合的百分比。与细胞系功能研究相关的所有数据详见补充表S15和S16。

所有数据存储在HTAN数据库中的研究访问编号phs002371（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gap/cgi-bin/study.cgi?study_id=phs002371.v6.p1），可通过HTAN DCC门户（https://data.humantumoratlas.org/）在HTAN WUSTL Atlas下访问。原始数据在应用dbGAP后即可获取，而处理后的数据则全部通过HTAN DCC门户提供。

本研究中使用的所有生物信息学程序均可从GitHub公共仓库（https://github.com/estorrs/3d-analysis）获取。

作者披露：
M.A. Reimers在提交的工作之外获得了来自Astellas/Pfizer、EMD Serono、Lilly、Curio Science、Total Health和Eisai的个人费用。A.H. Kim在提交的工作之外获得了来自Monteris Medical的个人费用以及来自Grace Medical的其他支持。S.V. Puram在提交的工作之外获得了来自Aveta Biomics的个人费用。J.A.J. Fitzpatrick在研究期间获得了美国国立卫生研究院和Chan Zuckerberg Initiative的资助。K.I. Shoghi在研究期间获得了国家癌症研究所的资助。G.J. Patti表示他是Panome Bio的首席科学官。M.G. Chheda在研究期间获得了美国国立卫生研究院的资助，同时还获得了NeoimmuneTech的非财务支持以及其他来自Merck、Orbus、Incyte、UpToDate和Telix的支持；此外，M.G. Chheda拥有US12274725B2、EP3638304、EP3638304A4、JP7525853B2和AU2018283957A1等专利；UpToDate通过提供版税提供了其他支持。B.J. Raphael在研究期间获得了国家癌症研究所的资助，在提交的工作之外获得了来自Merck的个人费用。其他作者没有披露任何利益关系。

作者的贡献：
E. Storrs：软件编程、数据分析、结果可视化、方法制定、初稿撰写、审稿和编辑。C.-K. Mo：数据分析、结果可视化、审稿和编辑。W.-h. Chou：软件编程、数据分析、初稿撰写、审稿和编辑。G. Bhatt：数据验证、审稿和编辑。S. Chen：数据管理及验证。X. Wei：数据验证。A. Houston：数据管理。A. Karpova：数据分析、审稿和编辑。R.G. Jayasinghe：项目监督、项目管理、审稿和编辑。P. Lal：数据管理。P. Bayguinov：数据管理。J.M. Herndon：数据管理。X. Li：数据管理。F. Anjum Simin：数据管理。X. Fang：数据管理。M.C. Wendl：审稿和编辑。X. Liu：数据分析。H. Zheng：数据分析。S.R. Davies：项目监督。J.T. Wang：数据分析、结果可视化、审稿和编辑。A. Shinkle：数据管理。R.S. Fulton：项目监督。J. Ponce：项目监督。M. Heinz：项目监督。R. Head：项目监督。D. Chen：项目监督。Y. Zhao：数据管理。D. Fenyo：项目监督。Y.E. Li：项目监督。C.X. Ma：项目监督。R. Aft：项目监督。M.A. Reimers：项目监督。A.H. Kim：项目监督。S.V. Puram：项目监督。J.A.J. Fitzpatrick：资源协调、项目管理。K.I. Shoghi：项目监督。R.S. Figenshau：项目监督。F.O. Ademuyiwa：项目监督。T. Ju：项目监督。G.A. Colditz：项目监督。B.F. Drake：项目监督。G.J. Patti：项目监督。S.T. Oh：项目监督。E.H. Kim：项目监督。W.E. Gillanders：项目监督。J.A. Olson Jr：项目监督。M.G. Chheda：项目监督、审稿和编辑。C. Weimholt：数据分析、项目监督。D.J. Veis：数据分析、项目监督。B.J. Raphael：项目监督。R.C. Fields：资源协调、数据管理、项目监督。R.K. Pachynski：资源协调、数据管理、项目监督。F. Chen：概念化、资源协调、数据管理、项目监督、方法制定、审稿和编辑。

致谢：
我们感谢参与这项研究的患者、工作人员和科学家，以及NCI、HTAN联盟和基因组数据分析网络的支持。同时感谢华盛顿大学细胞成像中心。我们也感谢Austin Southard-Smith、Andre Luiz Targino da Costa、Matt Wyczalkowski、Ambrose Plante、Clara Liu、Atieh Abedin Do、Kelsey Gallant和Susrutha Puthanmadhom Narayanan对文稿提供的反馈和技术支持。本研究得到了以下资助：U2CCA233303号资助给L. Ding、W.E. Gillanders和R.C. Fields；U01CA294532号资助给L. Ding、F. Chen、R. K. Pachynski和R. C. Fields；U24CA211006号资助给L. Ding；UH2CA263954号资助给J.A.J. Fitzpatrick、T. Ju.和S.T. Oh；R01HG009711号资助给L. Ding和F. Chen。此外，这项工作还得到了华盛顿大学医学院、外科和内科系、McDonnell基因组研究所、Siteman癌症中心以及Barnes-Jewish医院的资助。本文的补充数据可在Cancer Discovery Online（http://cancerdiscovery.aacrjournals.org/）获取。