《Vaccine》：Influence of vaccine delivery route on immune imprinting in influenza vaccination
摘要：流感疫苗 predominantly 通过肌肉内（intramuscular, IM）途径接种。然而，其有效性在不同季节、年龄组和暴露史之间仍然存在差异，这归因于免疫印记（immune imprinting）或原始抗原原罪（original antigenic sin）。免疫印记的产生源于生命早期对流感病毒的暴露，这种暴露会持久地使后续免疫应答偏向于针对初次感染株表位（epitope）的反应。这限制了初始B细胞（na?ve B cells）的募集以及针对抗原漂移（drifted）或抗原转换（shifted）病毒的应答广度。随着下一代通用疫苗日益关注保守抗原（conserved antigens）和新型平台，理解接种途径如何与印记相互作用已成为一个关键但尚未充分探索的问题。本综述总结了流感免疫印记的机制基础，以及疫苗递送途径可能如何调节印记应答。重要的是，直接证据表明接种途径可以通过改变表位层级（epitope hierarchy）或在已致敏宿主中募集初始B细胞克隆来重编程已建立的印记，这类证据基本上缺乏；大多数现有数据反而展示了途径依赖性的抗体亚型（antibody compartment）、免疫球蛋白亚类（isotype）和解剖定位（anatomical localization）的变化。研究人员描述了印记的细胞和分子特征，并比较了肌肉内接种与替代策略。研究人员强调，每种途径都会激活不同的抗原呈递细胞（antigen-presenting cell, APC）网络、淋巴样结构和全身性与黏膜性区室，这些因素可能影响克隆选择和表位层级。此外，研究人员讨论了递送途径、抗原设计和佐剂（adjuvant）之间的相互作用，将其作为一个可整合的设计空间，以潜在调节流感免疫和印记的表达。研究人员着重分析了用于研究途径依赖性印记的实验模型，并识别了关键的转化空白，包括对免疫史纳入有限、表位分辨（epitope-resolved）和黏膜读数使用不足，以及缺乏针对印记相关终点的临床试验。最后，研究人员概述了未来方向，主张通过保守抗原、佐剂和途径的合理组合，为拓宽和重新平衡印记应答提供一条可行路径。这对通用疫苗开发以及针对年龄或免疫史定制的疫苗接种策略具有直接意义。
1. 引言
流感仍然是发病和死亡的主要原因，尽管已有季节性疫苗。季节性疫情导致大量感染、住院和死亡，尤其在幼儿、老年人和合并症患者中。抗原转换的风险构成持续的流行病潜力，凸显了对更广谱、更持久保护疫苗的需求。当前肌肉内流感疫苗通常仅提供中等保护，并表现出强烈的株特异性。其有效性在不同季节和人群间差异很大。这种差异不仅源于抗原错配或免疫随时间衰减，还强烈受到免疫印记的影响，即历史上所称的原始抗原原罪。免疫印记是指适应性免疫系统倾向于回忆早期流感暴露（通常在儿童期）期间建立的B细胞和T细胞应答。因此后续感染或接种往往增强这些现有免疫应答，而非针对漂移病毒表位产生新应答。印记机制可提供针对相关株的保护，但也可能限制对漂移或转换株的应答广度，并限制更新疫苗的有效性。儿童期血凝素（hemagglutinin, HA）亚型印记通常以抗原资历（antigenic seniority）描述，主要在HA组或亚型水平上运作，并与相关病毒所致重症的保护相关，而后面章节讨论的更狭义的头区聚焦回忆现象主要涉及HA蛋白内的表位水平偏倚。流行病学上，儿童期HA亚型印记和抗原资历通常是有益的。出生队列研究表明，早期暴露于特定HA组或亚型可赋予对相关病毒重症的持久保护。因此印记并非纯待解决的问题，而是流感免疫的基本特征，以缩小对新株或抗原距离较远株的应答为代价降低风险。本综述主要聚焦头区聚焦回忆和表位水平偏倚限制疫苗广度的情况，同时承认组水平印记可能具有保护性。叙述性综述通过PubMed和Web of Science检索，使用“influenza”、“immune imprinting”、“original antigenic sin”、“antigenic seniority”、“vaccination route”、“intranasal”、“intradermal”、“microneedle”、“mucosal vaccine”、“universal influenza vaccine”、“adjuvant”等词组合，重点检索2000年1月至2025年3月的英文文章，并通过定向引文追踪补充早期和最新研究。
为克服印记并将应答转向保守表位，人们投入大量努力开发抗原中心方法，包括茎部聚焦或嵌合血凝素抗原、颗粒抗原、M2e、NP基抗原，以及结构引导设计以抑制头部免疫优势并促进交叉反应抗体应答。佐剂的使用旨在调节生发中心和滤泡辅助性T细胞（T follicular helper, Tfh）应答质量以增强广度和持久性。虽然这些方法已有前景结果，包括若干通用流感疫苗概念，但其最终成功取决于另一些体内影响抗原呈递和B细胞竞争的参数。
在免疫印记背景下受到相对较少关注的参数是接种途径。抗原沉积的解剖位置和免疫启动或回忆发生的局部组织微环境强烈影响所参与的抗原呈递细胞（APCs）、引流淋巴结、局部细胞因子环境以及全身和黏膜免疫之间的平衡。传统肌肉内（IM）注射主要诱导全身IgG应答，倾向于快速回忆针对先前抗原暴露的循环记忆B细胞（MBCs）。相比之下，鼻内递送靶向呼吸道黏膜和鼻咽相关淋巴组织（NALT），支持黏膜IgA和组织常驻记忆的发展。同时，皮内和微针方法涉及皮肤常驻免疫细胞如朗格汉斯细胞和真皮树突状细胞，可改变抗原运输和组织靶向；但在某些情况下，这些变化不转化为先天或适应性免疫应答的可测量差异。新兴或较少使用的递送策略，如口服、肺部、淋巴结靶向和植入或缓释系统，进一步扩展了抗原暴露可发生的组织环境范围。这些情境呈现不同的免疫细胞和信号条件组合，可能影响记忆和初始B细胞在免疫激活期间的竞争。这些差异提出可能性：接种途径可通过改变优先激活的B细胞群体并塑造所得免疫应答的广度和持久性来影响免疫印记。然而，系统研究不同递送途径如何影响免疫印记仍然有限。对替代或联合递送途径能否重塑已存在的印记流感免疫的清晰理解仍是一个重要且基本未解决的问题。研究人员区分为途径依赖性抗体区室变化与印记的真正改变，后者定义为已致敏宿主中表位层级变化或初始B细胞克隆募集。目前对后者的直接证据极少；大多数研究在免疫学上初始的动物中比较途径，或报告同种型和定位差异而不解析克隆竞争或表位特异性。
本综述阐述流感免疫印记的机制基础，探讨不同接种途径可能如何加强、调节或部分克服印记应答。概述印记的机制基础，比较传统肌肉内接种与替代和新兴递送途径，强调每个途径如何参与不同的组织常驻免疫区室和APCs。进一步讨论递送途径、抗原设计和佐剂在调节流感免疫中的相互作用。最后，强调实验模型、临床证据和转化空白，并提出未来方向，以利用递送途径作为重塑印记应答和支持通用流感疫苗发展的有意工具。
2. 免疫印记的机制基础
免疫印记或常被描述为原始抗原原罪的头区聚焦回忆模式源于免疫记忆。在再次暴露于抗原相关的流感病毒或疫苗抗原时，免疫系统优先回忆已有的记忆应答，而非针对新遇到表位启动新应答。当保守表位被回忆时这种偏倚可能有益，可预防再感染。但当记忆应答集中于漂移或不匹配表位时也可能变成限制。因此后续暴露的免疫应答质量不仅由抗原决定，还由先前暴露的顺序、时间和抗原相关性决定。
为区分相关术语，本综述中“免疫印记”作为流感免疫应答历史依赖性偏倚的总称，涵盖儿童期和成人期暴露。“原始抗原原罪”更狭义地指二次应答倾向于聚焦于首次或早期暴露中靶向的表位，即使后续抗原呈现新表位。“抗原资历”描述针对生命中较早遇到株的抗体应答层级性加强，尤其在HA亚型和系统发育组水平，可赋予对相关病毒重症的持久保护。相比之下，“头区聚焦回忆”指记忆B细胞应答优先靶向免疫优势HA头部表位而非更保守区域如HA茎部。综述机制部分主要处理这种更狭义的头区偏倚回忆过程，同时承认儿童期HA亚型印记在更广泛的组水平运作且可能有益。
记忆B细胞（MBCs）相对于初始B细胞在二次暴露后的竞争优势是印记过程的基础。MBCs数量更多、反应更快、需要较少抗原刺激，因此在早期抗原捕获和T细胞帮助中占主导。这种不对称限制初始B细胞募集，缩小后续暴露免疫应答的多样性。B细胞克隆在生发中心增殖、亲和力成熟和选择。尽管MBCs可重新进入生发中心，其早期优势可能扭曲抗原可用性，限制初始B细胞应答。
表位层级的持续性，特别是血凝素（HA）头部导向抗体应答对更保守茎部区域的优势，是免疫印记的关键特征。HA头部免疫优势且高度可及，而茎部更保守且免疫上亚优势。重复暴露于相关HA抗原倾向于强化这种层级，导致对株特异性头区免疫应答的强回忆。然而印记不限于头区导向应答。早期流感暴露也可塑造靶向HA茎部的MBC库，但这些应答可能仍反映初始印记株的结构特征，因此对后来遭遇的抗原不同病毒显示有限广度。抗原距离是决定印记是保护性、中性还是潜在限制的关键因素。当连续流感暴露密切相关时，记忆回忆可提供快速有效保护。但在中等抗原距离下，现有记忆应答可能仍主导回忆但未能有效中和流行株，这种模式常与原始抗原原罪相关。当抗原距离足够大时，初始B细胞更可能被募集，但早期暴露的印记仍可塑造所得抗体库及其分布。
首次暴露的性质和时机也塑造免疫印记。血清学研究表明儿童期流感暴露对流感特异性抗体库有持久影响。早期暴露可根据初免和攻击血凝素之间的系统发育关系偏倚对季节性和大流行病毒的应答。但印记并非纯粹儿童现象；新证据表明成人在顺序暴露于充分不同流感抗原时也可获得新印记偏倚。
虽然B细胞是免疫印记的核心，T细胞和先天免疫程序也影响结果。Tfh细胞质量、抗原持久性和抗原呈递的炎症背景影响二次应答是保持记忆克隆主导还是通过初始B细胞募集多样化。先天免疫激活可能支持更广泛的生发中心活性并帮助抵消印记记忆，但这一想法在流感中仍未充分研究。这些观察对疫苗接种特别相关，因为佐剂和递送途径可改变先天免疫感知、树突状细胞激活和淋巴组织参与，从而改变回忆和多样化之间的平衡。重复感染、季节性接种以及自然感染和疫苗暴露之间的差异可各自重塑流感特异性记忆群体的相对丰度、亲和力和解剖定位。自然感染导致识别头部和茎部区域的HA特异性MBC广泛扩增。相比之下，重复接种强烈加强已有应答，取决于抗原组成和先前免疫。
3. 递送途径
疫苗给药途径决定免疫系统如何遭遇流感抗原。不同途径将抗原沉积到具有不同APCs、细胞因子环境和屏障功能的组织，影响全身和黏膜免疫之间的平衡、生发中心应答质量以及记忆与初始B细胞克隆的相对募集。这些途径特异差异对免疫印记很重要，因为它们决定接种是放大已有偏倚还是支持应答向新型或亚优势表位多样化。
3.1. 肌肉内接种（IM）
IM注射是许可的季节性流感疫苗的主要途径，是评估替代策略的基准。它适合大规模给药，支持可复现剂量，并引发强体液免疫，特别是与常规血凝抑制（HAI）滴度相关的血清IgG应答。然而，肌肉组织含有的APCs相对少于皮肤或黏膜表面，且IM接种通常诱导呼吸道入口处有限的黏膜IgA。IM接种特别容易强化已有免疫偏倚。抗原迅速可及已有循环MBCs和Tfh细胞，促进偏向先前遇到的血凝素头部表位的有效回忆应答。这不是固有不良，因为当疫苗抗原与先前暴露抗原性接近时回忆应答提供有效保护。但这些偏倚可能限制针对漂移或新暴露表位的初始B细胞从头募集，在目标是重定向免疫超越已有印记时限制应答广度。IM途径能有效加强已建立的全身免疫，但在诱导组织常驻黏膜保护、拓宽表位覆盖和克服印记应答方面效果较差。
3.2. 鼻内接种
鼻内途径因靶向呼吸道黏膜（病毒进入和早期复制的自然部位）而特别受关注。通过将抗原沉积到鼻腔并参与NALT，鼻内递送促进与感染部位解剖匹配的免疫应答。该途径独特地诱导分泌型IgA、黏膜B细胞记忆和IM接种不能有效生成的组织常驻T细胞群体。与IM灭活流感疫苗（IIV）相比，鼻内递送的减毒活流感疫苗（LAIV）诱导更强的黏膜IgA和更广泛的T细胞介导应答。鼻内流感接种刺激交叉反应抗体应答，包括对异源HA抗原的IgA和IgG识别，与黏膜暴露可能拓宽回忆库的可能性一致。
鼻内接种将抗原引入独特黏膜免疫环境，参与局部树突状细胞和NALT，可能影响相对于IM接种的克隆竞争。黏膜接种不是复制相同的全身回忆层级，而是可能促进额外免疫层，包括局部抗体产生和组织常驻免疫应答，可补充或部分重定向已有印记全身记忆。因此黏膜递送不仅通过改变抗体同种型和定位，还通过改变哪些抗原靶点在病毒攻击部位变得功能相关来改变流感免疫。尽管有这些优势，鼻内接种也有局限。LAIV有效性受年龄强烈影响，儿童通常观察到的保护大于成人。成人已有免疫可限制疫苗病毒复制并降低抗原可用性，从而限制免疫应答。额外挑战包括制剂稳定性、安全性考虑，以及特别是非复制型鼻内疫苗平台需要有效黏膜佐剂。
3.3. 皮内和微针接种
皮肤是免疫学上丰富的组织，为IM接种提供有吸引力替代。表皮和真皮含密集朗格汉斯细胞、真皮树突状细胞、巨噬细胞和淋巴管网络，可有效捕获抗原并运输到引流淋巴结。皮内流感疫苗，包括微针制剂，已显示免疫原性相当于或大于IM接种且减少抗原剂量，证明途径依赖性差异在幅度和剂量效率方面。这对免疫印记有重要意义。从概念上讲，富含APCs和炎症感知途径的组织可能提供比肌肉组织更有利的Tfh支持、持续生发中心活性和更广泛克隆参与条件。虽然皮内接种与印记逆转的直接证据仍有限，但皮肤免疫生物学使其成为影响记忆回忆和应答多样化之间平衡的合理途径。
微针将疫苗抗原沉积到皮肤浅表角质层，密集免疫细胞网络可启动强免疫应答。微针可制为实心、包被、可溶、中空或水凝胶系统，每种提供不同水平的抗原递送、释放动力学和与佐剂共配制控制。流感接种中，微针方法反复证明免疫原性和保护效力相当于或大于传统IM递送。研究报告更强功能性抗体应答、更高细胞应答和流感攻击后肺中更快病毒清除。尽管有前景发现，广泛临床实施前仍有挑战：优化制剂设计、改善热稳定性、确保一致剂量递送、明确监管路径和支持大规模制造。此外，只有少数人体研究评估了流感微针疫苗并带详细机制免疫分析。尽管如此，微针流感接种提供最有前景的策略之一，用于修改已有印记流感应答被激活和回忆的免疫环境。
3.4. 替代和新兴递送途径
若干其他递送途径可能对调节流感印记有用，尽管大多数仍处于早期开发阶段。口服和舌下接种途径因无针且可访问黏膜免疫网络而吸引人。但这些途径有实质性制剂障碍，包括抗原降解、可变摄取和诱导耐受风险。这些挑战限制了流感疫苗的临床转化。然而，因为呼吸道外黏膜接触仍可能以区别于IM免疫的方式影响同种型平衡和局部记忆发展，概念吸引力仍强。
气溶胶和肺部递送是黏膜接种概念的直接延伸。根据颗粒大小和制剂，疫苗抗原递送到上或下呼吸道，产生局部和全身免疫应答。近期气溶胶流感疫苗研究显示增强黏膜免疫同时保持与IM接种相当的血清抗体应答。从印记角度看，肺部和气溶胶递送可能改变抗原可及性、组织常驻性以及局部回忆应答与病毒攻击部位病毒控制之间的空间关系。
淋巴结靶向是基于免疫工程的策略。不是依赖注射部位被动引流，工程纳米颗粒或其他靶向系统设计用于增加抗原递送到生发中心形成和克隆选择发生的淋巴组织。原则上这可改善滤泡应答质量和持续时间，减少优势记忆克隆快速回忆。虽然流感特异证据仍有限，淋巴结导向方法概念上重要，因为它们明确说明途径和组织靶向可用于修改印记的微解剖学。
植入或缓释系统进一步扩展此概念，控制抗原递送位置和持续时长。动物模型实验研究表明，延长抗原供应可维持生发中心反应、拓宽亲和力成熟，并允许募集否则在短暂回忆主导暴露期间被排除的克隆。这些观察为改善持久性提供机制依据，但此类平台长期保护数据尚不可得。这些系统在印记背景下特别有趣，因为免疫印记机制之一可能是已有抗体和MBCs快速获取抗原；改变抗原持久性可转移该平衡。尽管这些方法在流感疫苗学中仍主要是实验性，它们为超越传统推注注射提供有用概念框架。值得注意的是，这些效应源于受控抗原动力学和持久性而非仅解剖途径；类似抗原剂量和释放调节原则上可应用于肌肉内、皮内或黏膜平台。
最后，组合途径策略是改变印记应答的最实用方式之一。分离全身和黏膜区室的初免-加强方案，例如IM初免随后鼻内加强，或皮肤靶向初免随后黏膜加强，可利用多组织优势同时最小化单一途径局限。新兴数据表明全身免疫后黏膜加强可改善保护效力，强调途径排序可能是未来流感疫苗策略的重要设计变量。这些方案对免疫印记特别重要，因为它们提供向已有免疫记忆添加新解剖背景而非完全擦除的方法。表1描述主要流感疫苗递送途径的免疫学特征及其对免疫印记的概念性假设影响。
4. 递送途径与抗原设计之间的相互作用
抗原选择、佐剂制剂和疫苗递送途径的联合效应塑造流感特异性免疫。这种相互作用在免疫印记背景下特别重要，因为主要挑战不仅是增加抗体水平，而是影响识别哪些病毒表位、激活哪些B细胞群体以及哪些解剖区室成为主要保护位点。因此下一代流感疫苗的成功不仅取决于抗原设计，还取决于疫苗如何和在哪里递送以克服已有印记免疫应答。当前流感疫苗研究高度集中于保守抗原，如HA茎部结构域、神经氨酸酶（neuraminidase, NA）、基质蛋白2胞外域（M2e）及这些靶标的组合。研究中的方法包括嵌合和镶嵌血凝素构建体、茎部抗原、多价纳米颗粒疫苗以及以结构受控格式呈递抗原的病毒载体或mRNA平台。这些策略旨在拓宽交叉反应免疫。然而其有效性强烈取决于抗原首次遭遇或后来回忆的免疫环境。如果接种环境强烈促进已有头区特异性MBC快速激活，则设计为暴露保守表位的疫苗可能无法实现预期效果。因此疫苗制剂和递送途径成为抗原设计能否成功重定向免疫焦点的关键决定因素。
IM接种在产生全身免疫应答方面仍高效，但也倾向于支持循环记忆应答并强化已有印记模式，特别是当疫苗抗原因与先前感染或接种期间遭遇的抗原非常相似时。相比之下，鼻内接种将抗原直接递送到呼吸道黏膜，局部树突状细胞和鼻咽相关淋巴组织支持分泌型IgA和组织常驻记忆应答发展。这种黏膜环境对保守或异源抗原尤其重要，因为流感保护不仅依赖循环中和抗体，还依赖预防气道表面感染的能力。递送途径和抗原设计之间的关系在颗粒疫苗平台中特别明显。纳米颗粒疫苗可通过稳定抗原、促进多价抗原展示和改善向淋巴组织运输来增强免疫原性。但这些优势高度依赖给药途径。黏膜纳米颗粒疫苗可诱导局部和全身免疫应答。同样，微针皮肤递送颗粒流感疫苗已显示增加与皮肤抗原呈递细胞相互作用并改善功能性免疫应答，相比常规肌肉内给药。这些发现表明，接种途径可通过塑造免疫系统遭遇抗原的解剖和细胞通路来增强或限制给定抗原平台的内在优势。
佐剂通过调节参与抗原摄取、树突状细胞激活、细胞因子产生、Tfh分化和生发中心维持的先天免疫信号通路进一步影响疫苗诱导免疫。流感疫苗中，佐剂如MF59和AS03已显示增强免疫应答幅度，并在某些情况下拓宽对相关抗原的识别，部分通过募集和激活注射位点抗原呈递细胞。其他佐剂包括Matrix-M、鞭毛蛋白和STING激动剂也正被研究其增强通用流感疫苗和弱免疫原性保守抗原免疫原性的能力。在免疫印记背景下，佐剂最重要角色可能是改变已有MBCs和新募集初始B细胞之间的竞争平衡，而非简单增加总体抗体滴度。佐剂活性强烈受给药途径影响。相同佐剂根据递送到肌肉、皮肤或黏膜组织可产生不同先天免疫应答，因为这些环境在细胞组成、屏障功能和炎症阈值方面不同。黏膜佐剂必须克服呼吸道严格调控免疫环境同时保持安全性。这些制剂常依赖载体系统或毒素衍生组分增强上皮运输和局部免疫激活。
相比之下，皮内递送受益于皮肤中致密抗原呈递细胞网络和高效淋巴引流。猪近期工作进一步说明这种相互作用的重要性。一项研究中，STING靶向纳米颗粒佐剂皮内递送诱导更强交叉反应体液应答并比相同疫苗鼻内或肌肉内给药产生更高亲和力抗体。这一发现特别重要，因为它表明给药途径可决定佐剂是拓宽免疫应答还是放大已有免疫。然而，它本身并不证明在印记宿主中表位层级改变或初始克隆募集。
同样原则适用于专门设计用于克服印记的抗原。嵌合HA、HA茎部抗原和多组分通用疫苗候选物基于抗原本身进行评估。但其重定向免疫的能力取决于疫苗环境是否允许亚优势克隆进入并持续存在于应答中。例如茎部抗原可能受益于经皮或黏膜递送途径，这些途径促进延长抗原暴露、多样化APC参与或呼吸道表面组织匹配免疫。理论上优越的通用抗原如果通过快速将回忆引向已有头区记忆且无足够先天或解剖平衡的途径递送，则可能表现不佳。
这种整合视角帮助解释对途径特异性初免-加强接种策略日益增长的兴趣。例如，通过肌肉内途径递送保守或异源抗原可建立强全身免疫，随后鼻内加强可增强否则难以通过单独肠胃外接种实现的黏膜免疫广度。同样，皮肤靶向初免佐剂或颗粒抗原可促进有利滤泡免疫环境，随后全身或黏膜加强拓宽和延长应答。这些异源途径策略将不同解剖环境、先天免疫信号和表位暴露引入已建立免疫史。总之，抗原、佐剂和递送途径的组合应被视为通用流感疫苗开发中的整合框架。广谱保护抗原需要允许保守表位在已有印记免疫库中有效竞争的组织环境。同时佐剂选择不仅应考虑免疫刺激能力，还应考虑与给药解剖部位的相容性。因此影响印记流感免疫的理性方法取决于协调设计递送什么、如何刺激免疫应答以及免疫系统首次遭遇疫苗的位置，同时认识到当前证据主要支持同种型和解剖靶向的变化，而非已被证明的表位层级转移。
5. 研究途径依赖性印记的实验模型
确定疫苗递送途径能否重塑流感免疫印记需要同时捕捉免疫史和组织背景的实验模型。常规疫苗研究在免疫学初始动物中评估免疫原性。然而印记是顺序性的、历史依赖过程，其中新暴露结果取决于先前暴露。设计用于研究途径依赖性印记的模型应包含受控暴露史、遭遇之间抗原距离以及跨全身和黏膜区室的途径特异性免疫应答评估。
小鼠模型最常用，允许精确控制感染史、疫苗组成和组织采样。它们特别适合解剖B细胞竞争、生发中心和Tfh细胞应答以及佐剂或疫苗制剂效应。可设计顺序暴露模拟印记：建立初次暴露，让免疫记忆巩固，然后通过不同途径如肌肉内、鼻内或经皮递送抗原匹配、漂移或异亚型疫苗。小鼠模型主要优势是机制解析深度，包括可及淋巴结、骨髓、肺和黏膜组织进行细胞分析。但流感病毒在小鼠感染需要小鼠适应株，不完整复现人类疾病或传播。
雪貂自然易感人流感病毒，并紧密复现人流感感染的许多特征，包括疾病进展、病毒传播和临床症状。因此它们被认为是顺序暴露研究中最具信息量的临床前模型，其中初始流感感染后接种或暴露抗原不同株。雪貂研究证明首次流感暴露可对后续血清学和细胞免疫应答产生长期效应。这种初始印记影响疫苗反应性并可影响对异源和异亚型流感病毒的保护。这些特征使雪貂模型特别有价值用于研究替代疫苗递送途径如何塑造免疫印记。雪貂还提供研究途径依赖性免疫的重要优势，因为该模型中鼻内感染和呼吸道传播紧密类似自然人类流感暴露。这允许研究人员在生理相关感染条件下比较肠胃外和黏膜接种策略。尽管有优势，雪貂研究相比小鼠模型成本更高、实验通量更低。这些限制可能约束涉及多种抗原、佐剂和疫苗递送途径的大规模比较。因此雪貂模型通常最有效用于验证小鼠研究中最初确定的机制发现。
非人灵长类（NHPs）因其免疫学和生理学与人类接近而提供最高转化相关性。它们用于评估先进疫苗平台、黏膜递送和需要更人类样淋巴组织结构和免疫个体发育的复杂免疫终点。NHP研究已支持广谱保护流感疫苗开发，并有助于弥合机制动物发现与临床试验设计之间的差距。但其在途径依赖性印记研究中的使用受成本、群体规模以及模拟成人人群中观察到的多样化和长期免疫史难度限制。它们被认为是选定假设的确证系统而非大规模途径比较的发现平台。
少数其他物种在更专业情境中有所贡献。猪因呼吸道解剖与人类感染有有用平行而日益受关注，用于评估佐剂和黏膜流感疫苗。豚鼠和仓鼠可能有助于某些传播或感染研究，但作为印记深度免疫分析系统发展较少。因此对于途径依赖性免疫印记的具体问题，最具信息量的框架是分层方法：小鼠用于机制解剖，雪貂用于生理验证，NHPs或其他大型动物用于转化完善。无论物种，研究设计仍是印记的决定因素。有意义的途径依赖性印记模型应以明确初次暴露开始（感染或接种），随后足够长休息期让急性炎症消退并建立持久记忆。二次暴露随后应根据与初免株抗原关系、递送途径或疫苗制剂而变化。仅在初始动物中比较一种疫苗的设计揭示途径对免疫原性效应，但不能确定对免疫印记的影响。
免疫结果指标的选择是研究途径依赖性流感印记的关键考虑。常规终点如HAI滴度、微量中和试验和攻击后存活是有用的疫苗免疫原性指标，但不足以区分已有免疫应答的扩增与更广泛免疫多样化。因此机制研究应通过表征表位特异性、抗原特异性B细胞应答和组织特异性免疫群体的分析补充这些测量，以确定特定接种途径主要扩增已有免疫克隆还是募集新生成B细胞群体。
免疫采样的解剖部位同样重要。涉及鼻内、气溶胶或肺部递送的接种策略应使用鼻洗液、支气管肺泡灌洗和呼吸道组织分析评估局部IgA产生、常驻淋巴细胞群体和感染部位病毒控制。同样，皮肤靶向接种研究应包括皮肤引流淋巴结和局部抗原呈递细胞激活评估。这些区室特异性测量对于确定替代递送途径是增加全身免疫应答还是根本改变免疫回忆的组织和定位至关重要。另一主要挑战是准确模拟人类免疫史。流感印记通过终生多样化暴露发展，包括重复感染、年度接种和循环病毒株持续变化。尽管顺序暴露动物模型提供有价值的实验见解，它们应被视为受控近似而非人类抗原资历复杂性的直接代表。
6. 临床证据和转化空白
疫苗递送途径影响流感特异性免疫应答的质量、位置和幅度。然而，接种途径对免疫印记的影响仍未充分探索。人类流感疫苗研究评估常规终点如HAI滴度、血清转化、安全性和短期有效性。但表位层级、克隆回忆或基于不同免疫史的应答重定向等机制问题研究不足。因此现有文献提供证据表明途径很重要，但关于替代途径能否在克隆竞争和表位优势水平修改免疫印记仅提供间接且主要概念性证据。此外，一些实验研究（如表明途径改变抗原运输但不产生先天或适应性免疫读数的可测量差异的工作）强调途径依赖性组织靶向变化可在无相应下游免疫变化情况下发生。这些阴性结果对约束递送途径单独可能多强调节印记的预期很重要。
当前使用的疫苗平台中，重要比较是鼻内LAIV和肌肉内IIV。LAIV与更强黏膜和细胞免疫应答相关，而IIV诱导更高血清HAI滴度。这种分歧生物学上有意义，因为黏膜IgA和组织水平免疫与流感保护相关，但血清分析难以捕捉它们。然而LAIV在不同年龄组和季节表现变异，并已显示对少数株有效性低于IIV。这些结果突出关键转化教训：激活更广泛细胞或黏膜免疫的递送途径并不总导致更高有效性。LAIV在已致敏成人中的表现因此代表重要反例：尽管鼻内给药和更广泛黏膜免疫，已有全身记忆可限制抗原可用性和疫苗有效性，强调递送途径单独可能无法克服印记相关约束。皮内流感接种进一步提供递送途径影响疫苗性能的证据。皮内流感疫苗已显示引发与常规肌肉内接种相当且在某些情况下更强的免疫应答。几项研究还报告皮内递送的剂量节省效应。
微针流感接种因转化潜力而特别受关注。在1期随机临床试验中，递送灭活流感疫苗的可溶微针贴片显示良好安全性和免疫原性特征。体液和细胞免疫应答均与肌肉内接种观察相当，支持微针方法诱导流感特异性免疫的可行性。尽管有前景发现，当前微针研究在样本量和机制调查上仍有限。重要的是，尚无研究确定微针递送能否将已有流感免疫印记重定向到保守或先前未被充分认识的表位，特别是在有先前接种史的成人中。另一主要限制是流感疫苗评价中常用免疫终点范围狭窄。HAI滴度仍是疫苗免疫原性主要测量，但对替代接种途径是否修改免疫印记或仅强化已有免疫应答提供有限洞察。因此具有相似HAI应答的疫苗可能在产生免疫广度和质量方面差异显著，代表流感疫苗研究中的主要转化挑战。
第二个主要空白是免疫史纳入不足。流感印记由儿童期暴露、先前感染、重复接种以及过去和流行株之间抗原距离组合塑造。这些变量在临床疫苗研究中很少被充分详细捕获。年龄用作暴露史替代指标，但不能解析决定参与者通过多样化还是回忆对黏膜、经皮或肌肉内疫苗应答的印记模式。没有更好免疫史分层，途径特异效应可能被稀释、误解或完全遗漏。
第三个挑战涉及替代接种平台的制剂开发。黏膜疫苗必须克服制剂稳定性、局部耐受性、抗原保留和已有免疫引入的变异性问题。微针平台面临装置制造、剂量可复现性、可扩展性和批次间一致性障碍。即使免疫原性有前景，转化采用取决于可复现给药、可接受反应原性和对已建立肌肉内疫苗的明确临床优势。进一步限制是，对许多替代平台包括微针和缓释制剂，持续随访的详细持久性数据稀少；大多数研究报告短期免疫原性而非长期保护或广度维持。
未来临床研究应纳入免疫史基线分析和途径随机化设计，并仔细匹配抗原和佐剂。此外，评估途径依赖性免疫应答是否转化为改善保护需要研究设计同时评估免疫广度和临床相关结局，包括感染、病毒脱落和传播。
7. 结论与未来方向
接种途径帮助决定抗原在何处遭遇、参与哪些先天和抗原呈递细胞网络，以及已有免疫记忆是被加强还是应答被多样化。在此背景下，接种途径不应被视为相同抗原的可互换给药方式；相反它代表可能不同塑造印记应答的独特免疫背景。然而，途径单独不太可能“擦除”原始抗原原罪。它是更广泛策略的一部分，包括理性抗原选择和适当佐剂化。保守或免疫聚焦抗原，或多组分流感疫苗设计旨在拓宽免疫，但其成功取决于接种是否允许亚优势或新表位在印记库内竞争。黏膜和经皮途径可能特别有价值，因为它们募集标准肌肉内接种未充分利用的免疫区室，并扩展实现广度的解剖和细胞通路。
未来临床前和临床研究应基于上述实验和临床框架，确定疫苗递送途径如何与抗原选择和佐剂设计整合以实现特定免疫目标。加强常规株特异性免疫的最佳途径可能不同于促进更广或更持久保护所需途径。同样，佐剂选择不仅应考虑免疫原性强度，还应考虑与局部组织环境相容性，因为黏膜组织、皮肤和肌肉在抗原呈递细胞群体、耐受阈值和维持局部免疫记忆能力方面不同。将免疫史纳入疫苗设计和评估也将至关重要，因为流感印记因出生队列、地理区域、先前感染史和接种模式而异，可能影响对不同接种途径的应答。
未来研究应确定特定疫苗递送途径是否对具有不同免疫印记背景人群提供更大益处。这些发现最终可能支持针对年龄和免疫史定制的接种策略，旨在改善即时保护和流感免疫长期广度。疫苗递送途径对免疫印记的影响也超越季节性流感。这一研究领域连接通用疫苗开发、黏膜免疫学、生物材料和系统疫苗学。未来进展可能取决于整合保守抗原与优化递送方法。在此背景下，疫苗给药途径可能不仅仅是实用考虑；它可能作为靶向策略，修改免疫系统对流感的最初应答并促进更广泛、更持久和更公平的保护。
