《Advanced Functional Materials》：A Holistic Platform Approach for Developing Robust Pulmonary mRNA Delivery: Integrating Novel Phenolic Acid-Derived Ionizable Lipids and Device Engineering
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吸入式mRNA疗法的成功仍受到缺乏经气雾剂优化的可电离脂质以及制剂-装置相互作用理解不完整的限制。研究人员提出了一种整合新型脂质化学、系统性制剂工程和装置优化的肺mRNA递送集成平台。从一个新型酚酸衍生可电离脂质库中，研究人员基于可生物降解的丁香酸核心，将SY
吸入式mRNA疗法的成功仍受到缺乏经气雾剂优化的可电离脂质以及制剂-装置相互作用理解不完整的限制。研究人员提出了一种整合新型脂质化学、系统性制剂工程和装置优化的肺mRNA递送集成平台。从一个新型酚酸衍生可电离脂质库中，研究人员基于可生物降解的丁香酸核心，将SY-3鉴定为强效先导候选物。实验设计优化产生了LNP 5，这是一种在雾化稳定性同时表现出改善胞质递送潜力的制剂。在Cftr基因敲除小鼠中，包裹人CFTR mRNA的LNP 5重复雾化可产生稳健的蛋白表达，并恢复气道上皮中正确的顶端CFTR定位。装置表征显示，振动网格雾化器的选择对LNP完整性、气溶胶输出和质量中值空气动力学直径（MMAD）具有关键影响。总体而言，这些结果展示了一种涵盖可电离脂质设计、制剂优化和装置工程的整体开发策略，能够实现高效的肺部mRNA递送。尽管该研究成功展示了稳健的mRNA表达、体外功能性CFTR活性以及适当的体内组织定位，但在推进临床试验之前，仍需进一步验证，特别是鼻电位差和黏液清除测量等生理学评估。
mRNA-脂质纳米颗粒（LNP）技术已在疫苗领域取得巨大成功，但吸入式mRNA治疗慢性呼吸系统疾病仍面临显著挑战。当前的主要问题包括：缺乏针对雾化过程优化的可电离脂质；雾化产生的剪切应力会破坏LNP结构完整性；气道黏液层和极性上皮细胞屏障限制药物进入靶细胞；此外，制剂与雾化装置之间的相互作用尚未被充分理解。现有临床尝试如MRT-5005等仅显示出有限疗效，因此需要从脂质设计、制剂优化与装置工程一体化角度建立新的肺mRNA递送平台。该成果发表于《Advanced Functional Materials》。
研究人员开展了系统性研究：基于天然酚酸（芥子酸和丁香酸）设计并合成新型可电离脂质库，通过体内外筛选获得先导脂质SY-3；通过实验设计（DOE）优化LNP组成，获得兼具雾化稳定性和胞质递送潜力的LNP 5；进一步考察辅助脂质、PEG脂质、本体流体性质及雾化器类型对递送效率的影响；最后在囊性纤维化（CF）模型中进行功能验证。
关键技术方法包括：设计并合成了以芥子酸和丁香酸为母核的可电离脂质库；通过T-混合法配制mRNA-LNP；以CD-1小鼠（购自Charles River Laboratories）气管内给予FFLuc/mCherry mRNA进行体内筛选；利用Aerogen Solo和Pari eFlow振动网格雾化器进行雾化，采用动态光散射和RiboGreen法检测粒径、多分散系数和mRNA包封率；通过TNS法测定表面pKa，冷冻电镜观察颗粒形态，FRET法评价内体膜融合，激光衍射和下一代撞击器（NGI）测定气溶胶粒径与肺部沉积；在弗里希大鼠甲状腺（FRT）上皮细胞上进行Ussing chamber功能检测；在CFTR基因敲除小鼠（购自Jackson Labs）中重复雾化给予hCFTR mRNA-LNP，并用免疫荧光和RT-PCR评价表达与定位；正常人支气管上皮（nHBE）细胞（购自Lonza）用于气液界面（ALI）培养转染实验。
研究结果如下：
3.1 新型酚酸基可电离脂质的设计与筛选：芥子酸和丁香酸基脂质。通过三步合成法制备多种脂质，以FFLuc mRNA为报告基因，经气管内给药在CD-1小鼠中筛选。丁香酸基脂质SY-3产生最高的萤火虫荧光素酶表达，显著高于对照脂质；SY-3在肺S9组分中呈现时间依赖性降解，小鼠肺中半衰期约为3.8小时，血浆中24小时不可检出，表明其具备良好的可降解性和肺部滞留特征。
3.2 通过评估本体流体理化性质改善SY-3 LNP制剂的雾化特性。研究人员筛选了超过45种本体辅料条件，包括黏度调节剂、表面活性剂和离子强度调节剂。部分条件提高了雾化速率并减少了包封损失，但这些条件在体内未产生可检测的mCherry蛋白表达，说明仅优化本体流体性质不足以提升整体递送效果，需要多参数综合评估。
3.3 LNP组成优化以改善肺mRNA LNP特性。按SY-3摩尔比例将制剂分为40%、50%和60%三组。50%和60%组的总脂质载量较低，雾化速率显著提高，雾化后mRNA包封损失小于10%；DOPE含量与雾化性能相关性较强。II-50%组成在气管内给药中表现出较高的固有效力，其中LNP 5成为后续重点先导制剂。
3.4 辅助脂质对肺mRNA LNP特性的影响。比较不同磷脂酰胆碱（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）和DOTAP辅助脂质后发现，DOPE辅助脂质产生最高的蛋白表达；不饱和DOPC具有最高的雾化速率和最小的雾化后粒径及包封变化；DOTAP未显著增强表达。综合性能选择DOPE作为辅助脂质。
3.5 PEG脂质对肺mRNA LNP特性的影响。DMG-PEG-5000制剂在不存在黏液时具有较高转染活性，并在存在黏液时改善穿透，但其雾化输出速率低于DMG-PEG-2000，包封损失也更大。延长PEG脂质尾部碳链倾向于提高蛋白表达，但雾化速率下降。基于雾化速率、包封保持和体内表达的综合标准，LNP 5仍为优选。
3.6 优化SY-3 LNP组成雾化后小鼠肺中mCherry蛋白表达的测定。将LNP 1、LNP 5和LNP 10包裹mCherry mRNA经雾化给予小鼠，LNP 5在1小时和4小时暴露下的蛋白表达分别为LNP 1的134倍和25倍。尽管LNP 1的mRNA拷贝数更高，但蛋白表达更低，提示LNP 5具有更强的胞质递送能力；FRET融合实验和pKa约5.5的结果支持其改善内体逃逸。流式细胞术显示三种LNP均主要被肺上皮细胞摄取，LNP 5的mCherry阳性上皮细胞比例最高。初步耐受性评价显示LNP 5未引起明显急性炎症或肝毒性。
3.7 LNP 5包封hCFTR mRNA在体外和体内囊性纤维化模型中的功能评价。在FRT细胞Ussing chamber实验中，LNP 5递送hCFTR mRNA产生剂量依赖性短-circuit电流（ISC）增加，并可被CFTR抑制剂CFTRinh-172消除，证实功能性CFTR蛋白表达。在CFTR基因敲除小鼠中，每日重复雾化给予LNP 5-hCFTR mRNA后，肺组织hCFTR mRNA拷贝数从第2天起显著升高，第3–5天持续累积；免疫荧光显示CFTR蛋白定位于支气管上皮纤毛细胞顶端表面，表明恢复了正确的顶端定位。
3.8 不同振动网格雾化器与LNP 5制剂的评估以进一步改善雾化特性。与Aerogen Solo相比，Pari eFlow雾化器具有更高的雾化输出速率（约30 mL/h）和更小的LNP粒径变化；扫描电镜显示两者网孔几何结构不同。定制网孔研究表明，网孔数量而非网孔大小主要影响雾化速率；Type 35和Type 40网孔使MMAD分别约为5.1 μm和4.9 μm，NGI沉积分布显示药物可到达深肺区域，且各级沉积物中mRNA包封损失小于10%。
3.9 结论。在讨论中，研究人员指出吸入剂量和肺部沉积剂量尚未直接量化，未来需结合气溶胶浓度测量和呼吸模型进行准确评估；同时，向临床推进前还需开展鼻电位差、黏液清除等生理学功能验证，并评估长期毒性和免疫原性。研究结论翻译如下：本研究通过引入新型酚酸衍生可电离脂质，并证明其对雾化mRNA疗法的独特适用性，建立了肺mRNA递送的新设计框架。研究人员将SY-3鉴定为强效可生物降解候选物，其性能来源于分子架构、制剂组成和内体pH敏感性的协同贡献。通过系统优化辅助脂质和PEG化学，并绘制摩尔比对雾化行为的影响，研究人员开发出在雾化过程中保持结构完整性并能在体内外实现增强胞质递送和蛋白表达的先导制剂。重要的是，高效的肺mRNA治疗不能仅依靠脂质工程，还需使制剂特性与雾化装置的机械和热特性相匹配。Pari eFlow雾化器优于常用装置，可提高输出速率、减少LNP降解并实现生理相关的呼吸道气溶胶沉积。利用这种优化的制剂与装置组合，在CFTR缺陷小鼠肺中经重复给药实现了hCFTR的稳健翻译和正确顶端定位。总之，该工作定义了模块化、可扩展的脂质化学平台，为工程化可吸入LNP提供了机制蓝图，扩大了肺RNA药物的设计空间，并为治疗慢性呼吸系统疾病的下一代mRNA疗法奠定基础。
