小檗碱预处理骨髓间充质干细胞加速烧伤大鼠皮肤创面愈合

《International Wound Journal》：Berberine-Pretreated Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Accelerate Skin Wound Healing in Rats With Burn Injuries

　　

小檗碱(BBR)是一种天然异喹啉生物碱，具有抗菌、抗炎和促血管生成特性。本研究旨在探讨由小檗碱预处理的骨髓来源间充质干细胞(BMSCs-BBR)制备的条件培养基(CM)的治疗效果及其潜在机制。研究人员分离BMSCs并通过流式细胞术进行表型鉴定。在Wistar大鼠上建立烧伤创面模型，并将模型大鼠随机分为四组，分别接受安慰剂凝胶、标准BMSCs-CM凝胶、BMSCs-BBR CM凝胶或磺胺嘧啶银乳膏治疗。宏观监测创面愈合率。第21天，取皮肤组织进行组织学分析(H&E和Masson三色染色)，随后进行免疫荧光染色(CD31)和Western blot分析(I型胶原蛋白、III型胶原蛋白及PI3K/AKT/eNOS信号通路中的关键蛋白)。在所有治疗中，BMSCs-BBR CM最显著地加速了创面闭合，同时伴有表皮再生改善、胶原沉积和组织结构增强以及毛细血管密度显著增加。此外，接受BMSCs-BBR CM治疗的创面表现出I型胶原蛋白和III型胶原蛋白的显著上调，以及PI3K/AKT/eNOS通路的激活，表现为PI3K和AKT磷酸化增加以及eNOS蛋白水平升高。研究人员的发现表明，局部应用BMSCs-BBR CM凝胶通过改善组织再生质量和通过激活PI3K/AKT/eNOS信号通路刺激血管生成，有效促进烧伤创面愈合。这种预处理策略代表了一种有前景的无细胞治疗方法，用于烧伤创面管理。

小檗碱预处理骨髓间充质干细胞加速烧伤大鼠皮肤创面愈合

烧伤是全球第四大常见创伤类型，仅次于道路交通伤害、跌倒和人际暴力，每年导致约600万人次住院。烧伤创面以大量失活组织、过多渗出、高度感染易感性和显著瘢痕形成为特征。严重烧伤可引发全身炎症反应综合征，显著增加毛细血管通透性和血管阻力，导致患者死亡率和发病率升高。尽管早期手术清创和自体皮肤移植是深度烧伤的标准治疗，但大面积损伤患者仍面临自体皮肤可用性有限的临床挑战。近年来，再生医学的进展，尤其是基于干细胞的生物材料和先进皮肤替代品，为增强创面修复和组织再生提供了有前景的策略。

骨髓间充质干细胞(BMSCs)具有自我更新能力和多向分化潜能，其治疗获益主要归因于旁分泌因子，这些因子可促进抗凋亡、血管生成和有丝分裂活性。研究表明，植物化学物质可激活特定信号通路增强MSC迁移，从而动员细胞向受损组织聚集。小檗碱(BBR)是一种天然异喹啉生物碱，具有抗菌、抗炎和促血管生成特性。已有研究发现，BBR预处理的BMSCs在神经保护和骨再生方面表现出增强的功效，且BBR负载水凝胶可加速正常和糖尿病创面愈合。然而，BBR预处理能否增强BMSCs条件培养基对烧伤创面的治疗作用尚不清楚。因此，本研究旨在探讨BBR预处理的BMSCs来源条件培养基(BMSCs-BBR CM)对烧伤创面愈合的疗效及其潜在分子机制。

在方法上，研究人员从Sprague-Dawley大鼠（体重60–80 g）骨髓中分离BMSCs，并通过流式细胞术进行表型鉴定。通过CCK-8法评估BBR的细胞毒性，确定10 μM为最佳预处理浓度。收集未处理和BBR预处理BMSCs的条件培养基，制备含0.05%总蛋白的凝胶。在Wistar白化大鼠（8周龄，220–250 g）上建立全层烧伤模型，随机分为四组（每组6只）：模型组（安慰剂凝胶）、BMSCs-CM组、BMSCs-BBR CM组和磺胺嘧啶银乳膏组，每日给药并持续21天。第21天取创面皮肤组织，进行H&E染色、Masson三色染色、CD31免疫荧光染色和Western blot检测。

结果部分：

3.1 骨髓间充质干细胞的表型鉴定：流式细胞术分析显示，分离的第3代BMSCs对造血标志物CD34呈阴性（>90%阴性），而对黏附分子CD44、CD73、CD90和CD105呈高表达（>80%阳性），符合间充质干细胞免疫表型特征，表明成功分离了均一的BMSCs群体。

3.2 小檗碱对BMSCs的细胞毒性：CCK-8实验表明，1、5、10 μM BBR处理24小时不显著影响细胞活力，而20和50 μM则显著降低活力。因此，10 μM作为保持细胞活力>90%的最大非细胞毒性浓度，被选为后续预处理的最佳剂量。

3.3 BMSCs-CM联合BBR增强烧伤创面愈合：大体观察显示，在所有治疗组中，BMSCs-BBR CM处理的创面闭合最快，表现为多个时间点创面直径显著缩小。BMSCs-CM组也显示出加速愈合，但程度低于BMSCs-BBR组；磺胺嘧啶银组的效果介于两者之间。

3.4 BMSCs-BBR CM改善组织病理学改变并促进胶原组织排列：H&E染色显示，BMSCs-BBR CM处理的创面组织具有完全再生的表皮、形成良好的肉芽组织和极少的炎症细胞浸润。Masson三色染色显示，BMSCs-BBR组胶原纤维更厚、更密集且排列更规则，纤维化程度显著降低。

3.5 BMSCs-BBR增强愈合皮肤胶原沉积和血管生成：Western blot结果显示，BMSCs-BBR组创面中Collagen I和Collagen III蛋白水平较BMSCs组显著升高，表明细胞外基质合成增强。CD31免疫荧光染色显示，BMSCs-BBR CM处理的创面中CD31阳性微血管密度显著增加，证实其具有明显的促血管生成作用。

3.6 BMSCs-BBR激活创面组织中的PI3K/AKT/eNOS信号通路：Western blot分析表明，BMSCs-BBR CM处理显著增强了PI3K和AKT的磷酸化，并上调总eNOS蛋白水平，提示该信号通路被激活。这可能是其促进血管生成和组织再生的分子机制之一。

讨论部分指出，BBR预处理策略优于传统条件培养基疗法，通过激活PI3K/AKT/eNOS通路实现促进血管生成和胶原重塑。与磺胺嘧啶银相比，BMSCs-BBR CM在加速愈合和组织结构方面更优，但在胶原沉积和微血管密度方面低于磺胺嘧啶银组，研究人员推测这与磺胺嘧啶银的抗菌作用有关。研究结论：局部应用含BBR预处理的BMSCs条件培养基凝胶是治疗烧伤创面的高效策略，该疗法通过激活PI3K/AKT/eNOS信号通路促进胶原合成和血管生成，实现快速且高质量的组织再生。这一预处理策略为最大化MSC旁分泌因子的治疗潜力并发展为无细胞疗法提供了新方向。未来需要进一步通过蛋白质组学分析阐明分泌组组成，并通过功能抑制实验验证机制的因果关系，以推动该疗法的临床转化。