19F-MRI压缩感知加速的并行化61样品抑制筛选

《Small Methods》：Parallelized 61-Sample Inhibition Screening Accelerated by 19F-MRI Compressed Sensing

　　

¹⁹F NMR是早期药物发现中筛选配体的成熟技术。然而，常规NMR测量本质上是顺序进行的，这限制了实验通量。研究人员最近证明，¹⁹F磁共振成像（MRI）能够实现此类测量的空间并行化。在本研究中，研究人员利用了报告物检测模式，即在潜在竞争物存在下监测氟化报告配体的横向弛豫（T₂）。利用T₂加权MR图像，可同时分辨多达61个微型化样品。该筛选检测在定制的微型化蜂窝样品架中以微升级体积运行，提供了一种易于使用且可扩展的定量结合检测方法。为进一步加速数据采集，研究人员开发了基于压缩感知（CS）的优化成像协议，能够在不影响定量准确性的前提下大幅缩短测量时间。该方法允许并行筛选55种潜在配体，并通过同步剂量-响应实验高效测定相对结合亲和力。研究人员在模型蛋白胰蛋白酶和抗生素靶标PPAT上展示了该方法，表征了几种具有不同结合特性的配体。这项研究凸显了MRI在显著提高早期药物发现通量和效率方面的潜力。

论文解读：19F-MRI压缩感知加速的并行化61样品抑制筛选

早期药物发现流程中，化合物库的筛选和先导物的亲和力表征是关键步骤。理想筛选方法需同时具备高灵敏度（能检测弱结合）、高通量（可筛选大量化合物）和定量能力（可测定结合亲和力）。表面等离子体共振（SPR）、等温滴定量热法（ITC）、差示扫描荧光法（DSF）和核磁共振（NMR）等生物物理方法中，几乎没有一种能同时满足这三项要求：SPR和酶学实验对弱结合不敏感，ITC通量低，DSF的亲和力解析不明确。NMR本质上满足大部分要求，可检测极弱结合，并能在宽动态范围内定量解离常数。然而，NMR测量是顺序性的，每个样品需逐一采集，导致通量较低。前期工作中，研究人员利用磁共振成像（MRI）将9根NMR管同时插入仪器，使通量提高了9倍。为进一步提升通量和微型化水平，本研究设计了一种可容纳61个样品的蜂窝状样品架，将样品体积缩小至微升级，并结合压缩感知（CS）技术大幅缩短采集时间，从而构建了高通量、并行化的¹⁹F-MRI竞争性结合筛选平台。该研究发表在《Small Methods》上。

研究人员开展的研究内容为：利用定制蜂窝样品架（含61个圆柱形孔，孔内径约1.5 mm，壁厚约0.2 mm），在自制的¹⁹F射频线圈内同时容纳61个独立反应。筛选采用竞争性报告检测模式：氟化报告配体（如4-三氟甲基苄胺，TFBA）与靶蛋白结合后，其¹⁹F横向弛豫时间（T₂）缩短，信号减弱；当非氟化竞争物加入并置换报告配体后，¹⁹F信号增强。通过T₂加权MR成像，可定量信号恢复程度，从而判断竞争物的结合能力。为了加速数据采集，研究人员优化了压缩感知（CS）参数，仅采集43%的k空间数据（并保持43%的中心区域采样），在不显著损失定量准确性的前提下，将每样品的有效采集时间从常规实验的约18分钟降至约2分钟，实现9倍加速。该研究以胰蛋白酶作为模型蛋白，验证了方法的可行性；随后将其扩展至抗菌靶标磷酸泛酰巯基乙胺腺苷酰转移酶（PPAT）。

关键技术方法包括：定制蜂窝样品架（61孔，微升级体积）；¹⁹F-MRI成像采用RARE（快速采集弛豫增强）序列进行T₂加权成像，并使用多回波自旋回波（CPMG型）序列进行T₂弛豫时间定量；压缩感知采样策略（43%采样、43%中心区域）实现欠采样重建；报告配体TFBA（用于胰蛋白酶）和TTAPC（用于PPAT）浓度均为5 mM，蛋白浓度分别为300 μM（胰蛋白酶）和25 μM（PPAT）。样本来源：胰蛋白酶购自Sigma-Aldrich，PPAT按Lorz等人[31]的方法制备。

研究结果部分：

**2.1 Higher Sample Parallelization and Sparse Sampling**
通过将样品数从9个扩展到61个，并将报告配体浓度从25 mM降至5 mM、体积从60 μL降至15 μL，研究人员优化了信噪比和空间分辨率。系统考察了CS参数（采样比例S和中心区域比例CA），发现对于蜂窝样品架，当S降至40%–43%时仍可区分相邻孔，确定43%采样和43%中心区域为最佳平衡。此配置下，测得自由TFBA的T₂弛豫时间偏差仅约5%，单样品采集时间缩短至约2分钟，实现了9倍加速。

**2.2 Benchmarking With Known Competitors**
为评估方法检测弱结合剂的能力，研究人员使用三种已知不同亲和力的胰蛋白酶竞争物——强结合剂苯甲脒（BZD，表观K_i约35 μM）、弱结合剂苄胺（BZA，约300 μM）和极弱结合剂甲基苄胺（MZA，约1.5 mM）进行验证。剂量-响应实验表明，该方法可区分这些结合剂，并确定弱结合剂的浓度检测阈值。该实验确定筛选时竞争物浓度为30 mM，以确保弱结合剂也能产生可检测的置换。

**2.3 Highly Parallel Hit Screening**
在优化条件下，研究人员对55个化合物进行了并行筛选（含对照共61孔）。采用两点CPMG实验（TE 1.2 ms和5 ms），以TE=5 ms图像评估T₂加权对比度变化。根据报告配体TFBA的信号恢复分数，共鉴定出13个初始命中，分为强结合（信号恢复70%–99%）、弱结合（大于50%）和极弱结合（小于50%）。其中化合物7为已知强结合剂BZD，其余命中按化学结构归类。

**2.4 Binding Affinity Determination of Lead Competitors**
对13个命中进行剂量-响应滴定，使用多回波T₂弛豫测量获得位移分数F，拟合四参数剂量-响应方程得到EC₅₀，并结合Cheng–Prusoff关系转化为表观解离常数K_i。结果显示，化合物1、5、7、10为强结合剂（K_i约40–220 μM），化合物6、12为弱结合剂，而4、8、11因低位移量无法可靠拟合K_i。部分极弱结合剂（如4和8）在毛细管系统中（更大体积、更高SNR）被进一步验证，最终确定其K_i值。

**2.5 Application to the Antimicrobial Target Protein PPAT**
将方法应用于PPAT靶标，使用报告配体TTAPC（浓度5 mM，蛋白浓度25 μM），筛选三个已知PPAT配体（14、15、16）及六个胰蛋白酶命中作为对照。剂量-响应T₂图谱显示，化合物16（甲氨蝶呤）竞争性最强，表观K_i为18 μM；化合物15（苯并氨基甲基苯酚）K_i为47 μM；化合物14（联苯基苯基脲）K_i为498 μM。同时，对照中的化合物10在初始筛选中表现为假阳性，剂量-响应实验发现其信号变化无系统性趋势，归因于高浓度下溶解度差。这一步骤展示了剂量-响应实验对排除假阳性的价值。

讨论部分指出，该方法在筛选模式下可同时检测多个结合剂，但高浓度（30 mM）可能超出许多有机化合物的溶解度，导致聚集或伪影。通过结合超极化技术，有望将各组分浓度降低数个数量级。本研究通过将61孔微型化阵列与CS相结合，显著提高了¹⁹F-MRI的筛选通量，并将工作流程成功应用于疾病相关的PPAT靶标。结论部分（翻译）：药物发现的节奏从根本上受限于化合物筛选的速度。同样重要的是，该工作流程的灵活性允许在宽亲和力范围内检测配体，同时保持与制药发现中微升级检测体积的兼容性。通过定制蜂窝样品架，研究人员在¹⁹F线圈内实现了61个物理隔离的反应器的同时成像。利用T₂图谱作为读出的筛选模式下，基于T₂加权对比度识别命中/未命中，通过竞争分数（%F）和剂量-响应滴定中的T₂弛豫测定结合亲和力（K_i）。在筛选模式下，使用TFBA报告配体成功为胰蛋白酶鉴定13个命中；在命中表征中，确定了6个先导化合物对胰蛋白酶的K_i值，并评估了3个化合物对PPAT的K_i值，将方法从胰蛋白酶扩展至疾病相关蛋白。强置换剂在蜂窝装置中被可靠检测，弱结合剂则通过集成毛细管系统提高SNR来定量。该方法的局限性在于报告配体和竞争物浓度比常规生化测定高2–3个数量级，需要高溶解度化合物。压缩感知使采集时间缩短至全采样的43%，每全套样品约2分钟，实现9倍加速。结合超极化技术，该方法有潜力成为快速、平行、可扩展的蛋白-配体检测平台，为早期药物发现、片段筛选和多重分析开辟新途径。