《Signal Transduction and Targeted Therapy》：Nucleic acid aptamers: new methods for selection, target validation, molecular diagnostics and therapeutics
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核酸适配体（Nucleic acid aptamers），常被称为“化学抗体”（chemical antibodies），是一类多功能、特异性强且易于修饰的功能性核酸。目前，研究热点集中于开发适配体筛选与靶标验证的新方法，以拓展其在分子诊断与治疗中的生物医学应
核酸适配体（Nucleic acid aptamers），常被称为“化学抗体”（chemical antibodies），是一类多功能、特异性强且易于修饰的功能性核酸。目前，研究热点集中于开发适配体筛选与靶标验证的新方法，以拓展其在分子诊断与治疗中的生物医学应用。本综述共分为八个部分。第一部分简要介绍适配体，并回顾其在分子诊断与治疗中的发展历程。“适配体在分子诊断与治疗中的优势”部分总结并讨论了适配体在这些领域的优势。“适配体筛选新方法”部分介绍并讨论了核酸适配体筛选方法，包括经典方法和新型方法。在“靶标验证新方法”部分，研究人员探讨了靶标验证的新方法，涵盖适配体结构验证、靶标识别验证以及适配体-靶标相互作用验证。“分子诊断新方法”部分总结并讨论了适配体在分子诊断中的最新应用，特别关注新机制和检测策略及其在多种疾病中的应用。“分子治疗新方法”部分总结并讨论了适配体在分子治疗中的最新应用，强调新机制和基于适配体的治疗策略及其在不同疾病中的治疗应用。“核酸适配体的挑战与未来展望”部分阐述了适配体在疾病诊断与治疗中面临的挑战和未来前景。最后，“结论”部分分享了研究人员对适配体在临床疾病分子诊断与治疗中未来发展方向的观点。
引言
核酸适配体是能够与靶标分子结合的短链单链脱氧核糖核酸（ssDNA）或核糖核酸（RNA）分子。1990年，Joyce、Szostak和Gold实验室分别独立报道了适配体。适配体通过指数富集配体系统进化（SELEX）过程筛选获得，这是一种利用大型核酸文库的迭代筛选方法。在此过程中，与靶标分子结合的适配体序列被富集。候选结合序列经过多轮筛选以增加高亲和力物种的群体，直至其在文库中占主导地位。“适配体”一词由Ellington创造，源自拉丁语aptus（意为“适合”）和希腊语meros（意为“部分”）。适配体是除抗体外，少数可被工程化设计以结合多种不同靶标的分子类别之一。针对活靶标引入SELEX技术，包括活细胞（cell-SELEX）、组织样本（tissue-SELEX）和完整生物体（whole organism in vivo SELEX），标志着适配体发现的重大进展。迄今为止，已产生了数千种针对广泛靶标的适配体，包括蛋白质、肽、有机分子、小金属离子、病毒、细菌、全细胞，甚至活体动物内的靶标。
核酸适配体具有独特的三级结构，使其能够特异性结合相应的分子靶标。由于其靶向和结合方式类似于传统抗体，常被称为“化学抗体”。然而，适配体更经济、更易合成，同时保留了与抗体相当的特性。此外，适配体筛选过程通常比单克隆抗体更快，并可通过连续多轮的进化筛选和修饰来优化结合亲和力。适配体易于组装成具有活性药物或探针的多功能复合物，使其作为精准医疗的“魔弹”特别具有吸引力。多种基于适配体的分子诊断平台已被广泛开发，用于疾病诊断、传染病防控、即时检测（POCT）和可穿戴诊断设备。此外，适配体可以特异性递送小分子化疗药物、寡核苷酸、肽、蛋白质甚至“活体药物”至靶细胞和组织，以实现高效的分子治疗。许多临床疾病，包括癌症、心血管疾病和神经退行性疾病，均已从基于适配体的分子治疗中获益。
尽管适配体自1990年代初起已被研究近40年，但学术界和私人投资者的兴趣直到最近才赶上其他基于核酸的治疗方法和单克隆抗体（mAbs）。目前，仅有两种适配体药物获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准。第一种是培加他尼钠（Macugen），一种靶向血管内皮生长因子（VEGF）的RNA适配体药物，于2004年被FDA批准用于治疗年龄相关性黄斑变性。第二种RNA适配体药物avacincaptad pegol（Izervay）于2023年被批准用于治疗年龄相关性黄斑变性继发的地理萎缩（GA）。最初阻碍适配体作为治疗药物使用的两个主要障碍是天然寡核苷酸的免疫原性和对血清核酸酶的高度敏感性。为解决这些问题，后续深入研究开发了在核苷酸和/或骨架上具有特定化学修饰的适配体，显著降低了免疫原性潜力，并将酶促降解抗性从几分钟提高到数天。这些修饰增强了适配体的临床适用性。此后，COVID-19疫苗和肿瘤疫苗的爆炸性发展等因素激发了人们对适配体疗法的兴趣。根据临床试验数据（ClinicalTrials.gov），截至2026年3月15日，已有超过71种适配体相关试剂进入临床测试。这些努力加速了基于适配体的分子诊断和治疗的开发及临床实施。
适配体在分子诊断和治疗中的优势
人体是由无数以高度有序和协调方式工作的分子机器组成的复杂系统。异常分子状态是疾病发生和发展的主要原因。异常分子，如突变基因、过表达膜蛋白和异常分泌蛋白，已成为疾病诊断和治疗的关键靶标。分子诊断和治疗是前沿精准医疗的组成部分。精准医疗又称个体化医疗，是一种根据每位患者的个体特征定制医疗方案的新兴医疗方法。基于核酸适配体的分子工具在精准医疗中发挥着关键作用，并日益受到关注。
作为最成熟的分子工具之一，抗体已被探索了一个多世纪，适用于各种分子诊断和治疗应用。抗体和抗体-药物偶联物（ADCs）已成为疾病检测和治疗最流行的策略。尽管抗体技术在诊断和治疗中发挥着重要作用，但其并非没有局限性。例如：抗体必须通过生物方式生产，成本不可避免较高；针对脂质、碳水化合物和有机大分子的抗体筛选往往导致亲和力和特异性平庸；抗体的大尺寸通常减缓组织渗透；抗体与药物共价偶联的关键标准是保持其对受体的亲和力和特异性；抗体上功能分子存在非特异性偶联位点；还存在其他固有问题，如有效载荷偶联数量有限，导致高成本以及巨大的时间和精力消耗。
适配体是一类人工配体，在筛选过程中扩展了潜在靶标的范围，包括小分子和离子。适配体的分子量小（5–15 kDa），而抗体为150–1000 kDa，纳米抗体为12–15 kDa，因此具有更高的结合密度。其较小的尺寸使其比大尺寸抗体移动更快，更频繁地遇到生物膜结构，并由于较少的空间位阻和相对较高的扩散速率而更容易扩散到结合位点。在生物安全性方面，适配体体积小且基于核酸，几乎没有毒性或免疫原性。临床和临床前试验表明，人体可以耐受微摩尔水平的寡核苷酸，且适配体比抗体能更深地渗透到肿瘤核心。在化学方面，适配体比抗体和纳米抗体更容易化学合成和修饰，适合使用固相技术进行大规模合成，质量一致，批次间差异极小。在靶标方面，适配体比抗体具有更广泛的靶标库，可在天然条件下针对多种靶标进行筛选，包括金属离子、小有机分子、蛋白质、糖、脂质，甚至全细胞或病毒。在成本方面，适配体可在体外化学合成，生产更快、更经济。适配体在恶劣条件下（包括高温）稳定，保质期更长。此外，适配体易于运输，无需冷链要求，降低了长期储存和运输相关成本。
适配体筛选新方法
核酸适配体卓越的识别能力和多功能的治疗潜力催生了对稳健发现方法学的日益增长需求。然而，适配体的实际转化长期以来一直受到传统SELEX固有局限性的瓶颈制约，包括劳动密集型的迭代循环、结合亲和力不足以及缺乏生物学功能。为克服这些挑战，新一代创新筛选平台最近涌现，标志着从经验筛选向精准工程的范式转变。新的代表性筛选技术包括Pro-SELEX、核酸酶辅助策略、基于RaptGen的人工智能（AI）技术、整合单细胞扰动驱动的适配体识别和动力学测序（SPARK-seq）平台。这些方法将传统方案发展为更高通量、更强亲和力和功能导向的筛选。此外，智能算法和多模态整合的引入简化了从初始文库分区到最终先导物鉴定的路径。
高通量适配体筛选平台
高通量适配体发现平台通过先进的分离技术规避了传统劳动密集型离心或磁分离的瓶颈。目前，进化选择平台包括由精确流体动力学控制的微流控架构、利用差异分子扩散的水凝胶基质以及基于梯度的热力学洗脱。这种从大规模文库中高通量分离靶标结合序列显著加速了筛选过程，甚至将多轮循环减少到单轮。
在微流控辅助筛选中，Pro-SELEX代表了范式转变，它整合了高效粒子展示、微流控分选和生物信息学。DNA文库通过乳液聚合酶链反应（PCR）转化为单克隆微球，并与磁性靶标孵育。Pro-SELEX利用受控层流根据磁载荷物理分馏微球，能够快速发现具有精确定义亲和力的适配体。此外，基于微流控分选，设计了大规模并行筛选平台，可将几乎任何适配体转化为结合诱导的构象分子开关，无需先验结构知识。
然而，微流控方法常受限于专门仪器和有限的文库通量。UltraSelex通过标准化连续洗涤级分的收集来开发，追踪所有级分中的结合物以识别最初稀有的序列。UltraSelex处理更大的RNA文库（1013–1014），在无需精密设备的情况下展示了更广泛的适用性。为进一步减少非特异性结合，水凝胶适配体筛选（HAS）提出了一种无需仪器或无需珠子的SELEX系统，利用三维（3D）非污染大孔水凝胶内游离分子的浓度梯度促进耦合扩散-结合过程。
尽管出现了多种高通量技术，但它们缺乏扩展优化和深入的机制研究，如优化系统稳定性、适应复杂临床样本或转化为商业化和产品化。此外，针对活细胞的高通量筛选仍然是一个挑战。
高亲和力适配体筛选平台
传统SELEX方法主要依赖浓度压力来富集高亲和力序列。然而，这种选择压力往往不足以有效分离高亲和力适配体，导致结合性能出现平台期。因此，一系列精密策略被相继开发，包括将结构引导的表位靶向或不可逆共价交联整合到初始文库设计中，以及通过核酸酶辅助动力学过滤优化筛选过程。
现代平台将潜在生物反应性化学和结构约束直接整合到文库设计中，以超越热力学边界。通过引入亲电弹头，邻近驱动的反应可将瞬时复合物转化为永久共价偶联物，实现不可逆抑制剂或长效膜蛋白标记适配体的快速发现。此外，设计具有固定基序的文库可将选择压力转向优化局部适应度景观，确保侧翼序列进化以提供稳定活性构象所需的三级相互作用并最大化亲和力。
功能设计也被引入文库构建中，用于发现高亲和力适配体或实现适配体的生物学效应。Blocker-SELEX和Baited SELEX等策略使用诱饵伙伴或活性位点“诱饵”来分离重叠关键蛋白-蛋白相互作用（PPI）界面或催化口袋的适配体。功能基团引导的选择利用简化类似物来指导锚定基序针对特定化学基团的进化，克服复杂分子的负协同性，识别不可成药靶标的结合物。这种向功能效用演进的趋势进一步体现在基于适配体的降解剂中，利用双特异性嵌合体劫持泛素-蛋白酶体系统，将高亲和力结合物转化为靶向蛋白降解的有效治疗工具。
此外，各种DNA加工酶，如内切核酸酶或外切核酸酶，被整合到筛选过程中，将“结合事件”转化为“酶抗性”以产生高亲和力适配体。经历靶标诱导构象转换的适配体可掩盖切割位点并在消化中存活，使具有慢解离速率的高亲和力结合物在溶液中持续存在，而背景序列被快速水解。
AI驱动的适配体筛选平台
AI与高通量测序数据的整合催化了适配体发现的范式转变，从随机物理筛选转向理性计算设计。AI驱动平台利用先进的机器学习架构，从生成模型到深度强化学习，解码序列、结构和结合亲和力之间的复杂非线性关系。2022年RaptGen的引入从根本上重塑了AI驱动适配体发现的格局，这是一个将变分自编码器（VAE）与profile隐马尔可夫模型（HMM）解码器整合的先驱框架，可捕获基本基序架构。RaptGen通过在连续低维潜空间中导航，实现了新型适配体的硅内生成。
随后，AptaDiff和深度学习辅助SELEX（DL-SELEX）大幅扩展了这一技术库。AptaDiff利用基于扩散的生成和基序依赖性嵌入，在序列多样性和保真度方面优于早期模型。DL-SELEX通过使用深度学习设计结构增强的初始文库来优化发现流程，将实验迭代减少高达80%。SILEX平台通过利用无监督聚类，从单轮筛选中解码结构-功能关系。RhoDesign平台代表了超越RaptGen时代的决定性演进，实现了基于结构到序列转换器架构，可直接从靶标的3D点云或预定义结构折叠工程化RNA适配体。
然而，当前AI框架大多在理想化的刚体假设下运行，无法模拟动态生理环境。此外，训练数据集缺乏来自失败SELEX轮次的阴性非结合序列数据，常导致生成模型预测具有高脱靶交叉反应性的候选物。与传统基于实验室的SELEX不同，深度学习架构通常作为黑箱运行，缺乏算法透明度，给监管和安全性带来挑战。
多模态整合适配体筛选平台
传统基于细胞的筛选保留了靶标的天然构象并增强了所选适配体的实际功效，但仍存在“黑箱”局限性。2023年，CRISmer系统通过将CRISPR/Cas重新用作细胞内报告器开创了这一转变，将分子识别直接耦合到转录输出，识别针对SARS-CoV-2刺突蛋白的适配体。CRISPR-Hybrid平台和GRAPE-LM框架通过将实验通量与预测智能融合，引入了更深层次的多模态协同。SPARK-seq平台通过将CRISPR-based遗传扰动与单细胞多组学整合，实现了全流程整合，在单细胞分辨率下同时分析适配体结合、靶标表达和细胞表型。SPARK-seq将筛选平台转变为多维发现工具箱，用于理性适配体药物开发。
靶标验证新方法
筛选平台的快速发展有效解决了发现瓶颈，产生了大量潜在适配体候选物。然而，将这些先导适配体功能转化为精准治疗或诊断工具需要严格的多维验证框架。验证阶段对于解码结构原理和确保复杂生理环境中的靶标特异性至关重要。
适配体结构验证
适配体结构表征通常依赖圆二色（CD）光谱和热力学折叠算法等低分辨率技术。虽然这些方法提供了二级结构基序的基本见解，但仅提供平均数据，往往无法预测三级折叠或复杂生理环境中的特定分子间相互作用。为克服这些限制，相关研究已转向原子分辨率成像和生成式人工智能，以实现快速、高精度的结构预测。
核磁共振（NMR）波谱法能够独特地捕获动态平衡和适应性结合转变，可在近生理液体环境中确定中小型DNA/RNA适配体的构象多样性。NMR可以明确分配定义适配体独特折叠的糖苷键角和氢键模式。冷冻电子显微镜（Cryo-EM）已成为解析大型适配体-靶标复合物原子结构的强大工具。AI驱动的预测建模为结构验证提供了补充途径，能够从序列信息快速生成高精度的三维结构模型。
适配体识别靶标验证
确认适配体在复杂生物环境中的靶标特异性至关重要。下拉实验（pull-down assays）结合液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）已成为鉴定适配体识别靶标的主流方法。CRISPR介导的功能基因组学提供了正交验证途径，通过基因扰动确认靶标的功能相关性。
适配体-靶标相互作用验证
亲和力表征用于确定结合常数，是适配体-靶标相互作用验证的基础。相互作用作图技术可精确定位结合位点。深度学习方法可精确识别结合位点和相互作用模式。
分子诊断新方法
适配体在分子诊断中的应用涵盖液体活检、生物传感器、成像、生物标志物检测以及POCT和可穿戴设备等领域。基于适配体的分子诊断平台已被广泛开发用于疾病诊断、传染病防控、即时检测和可穿戴诊断设备。
分子治疗新方法
适配体在分子治疗中的应用包括适配体-药物偶联物、适配体-纳米颗粒偶联物、适配体驱动的活体药物递送、免疫治疗、抗癌治疗以及抗病毒和抗菌治疗。适配体可以特异性递送小分子化疗药物、寡核苷酸、肽、蛋白质甚至“活体药物”至靶细胞和组织，以实现高效的分子治疗。
核酸适配体的挑战与未来展望
尽管适配体具有巨大潜力，但在疾病诊断和治疗中仍面临挑战。这些挑战包括筛选效率、亲和力优化、体内稳定性、药代动力学特性、监管审批以及临床转化等。未来展望包括开发更高效的筛选方法、增强适配体的功能性和稳定性、推进临床研究以及建立标准化评估框架。
结论
核酸适配体作为一类重要的功能性核酸，在分子诊断和治疗领域展现出广阔的应用前景。随着筛选技术、靶标验证方法和化学修饰策略的不断进步，适配体有望在精准医疗中发挥越来越重要的作用。未来，适配体的发展方向将集中于提高其临床适用性、推进更多适配体药物进入临床以及开发创新的适配体-based诊断和治疗平台。
