《Scientific Reports》：Integrated analysis of single-cell and transcriptome data reveals temporal dynamics of microglial phagocytic reprogramming in neuropathic pain progression
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神经病理性疼痛（neuropathic pain, NP）常由急性向慢性转变，但驱动该转变的机制尚不清楚。小胶质细胞（microglia）在脊髓敏化中起核心作用，但其于疼痛慢性化过程中的功能演化仍知之甚少。研究人员通过整合多组学分析与实验验证，系统探究 spa
神经病理性疼痛（neuropathic pain, NP）常由急性向慢性转变，但驱动该转变的机制尚不清楚。小胶质细胞（microglia）在脊髓敏化中起核心作用，但其于疼痛慢性化过程中的功能演化仍知之甚少。研究人员通过整合多组学分析与实验验证，系统探究 spared nerve injury（SNI）小鼠模型中脊髓小胶质细胞在 NP 进展期吞噬功能重编程的时间动力学。结果显示，SNI 后脊髓小胶质细胞经历三相功能演进：伤后第3天（PID3）为初始吞噬活化的急性增殖态；PID7 为吞噬通路显著激活的过渡相；PID14 进入慢性吞噬“疲劳”态，自噬（autophagy）与溶酶体（lysosome）相关通路活性下降，吞噬与降解能力功能性脱钩。单细胞转录组进一步揭示炎症调节亚群（如 Micro3/Micro5）与专职吞噬簇（如 Cluster 7）的异质性；拟时序（pseudotime）分析表明小胶质细胞从共同祖态分化为促炎或吞噬两条命运。慢性相（SNI 后第14天）证实小胶质细胞活化、神经炎症与痛觉超敏，并新发现其吞噬凋亡细胞增强。研究人员鉴定出 8 个吞噬相关基因（如 Axl、Mfsd8、Mbtps1、Sorl1），其中 Axl 在慢性相上调最显著；体内外实验证实抑制 Axl 既诱发机械性异常疼痛（mechanical allodynia）又损害小胶质细胞吞噬功能。LPS 刺激下小胶质细胞吞噬呈双相反应：先增强后下降。该工作为小胶质细胞吞噬重编程提供新见解，并提出 Axl 作为慢性 NP 的潜在治疗靶点。
研究背景方面，神经病理性疼痛（neuropathic pain, NP）是全球约10%人群受累的慢性痌态，源于体感觉神经系统损伤后的适应不良可塑性。现有药物多靶向症状而非机制，对急性向慢性转变的细胞与分子动力学认识不足。脊髓背角（spinal dorsal horn）是NP进展中适应不良可塑性的关键位点，小胶质细胞（microglia）作为神经免疫串扰（neuroimmune crosstalk）的核心调节器，在神经损伤后释放IL-1β、TNF-α、ATP等促炎介质放大神经元兴奋并募集星形胶质细胞（astrocytes）。但小胶质细胞吞噬清除功能随时间如何演变、亚群功能多样化的分子决定因素仍不清楚。脊髓中凋亡细胞蓄积提示efferocytosis（清除凋亡细胞的特化吞噬）失调，因此研究人员开展本研究以绘制SNI模型中脊髓小胶质细胞吞噬重编程的时空地图并筛选关键基因。
论文发表于《Scientific Reports》。研究人员采用公开GEO数据集开展整合分析：批量RNA-seq含GSE111216、GSE241361；单细胞RNA-seq含GSE134003（全脊髓）、GSE246288（CD11b+小胶质富集，PID3/PID7/PID14）、GSE162807（小胶质，PID3/PID7/5月）。方法上以Seurat做质控与聚类，Harmony校正批次效应，GSVA（gene set variation analysis）评通路活性，CellChat推细胞间通信，Monocle建拟时序（pseudotime），SCENIC析转录因子调控，并辅以SNI小鼠模型、鞘内注射Axl抑制剂R428、von Frey测机械性异常疼痛、BV2细胞LPS刺激吞噬实验及免疫荧光/WB验证。
Spinal cord transcriptomic data analysis suggests that SNI induces an upregulation of phagocytic function following neuropathic pain：研究人员重分析两个批量RNA-seq，发现Cd33、P2ry12、Ccl7上调，GO（gene ontology）富集白细胞迁移趋化，GSEA（gene set enrichment analysis）见TNF-α/NF-κB、IL-6/JAK/STAT3与凋亡通路，KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）确认Fc gamma R介导吞噬与phagosome通路，表明SNI后脊髓炎症与吞噬程序共激活。
Single-cell profiling identifies microglia as the dominant phagocytic population in spinal cord in SNI-induced neuropathic pain：对GSE134003聚出18类细胞，GSVA与UCell评分显示小胶质和巨噬细胞在凋亡、补体、炎症通路得分最高，CellChat示小胶质高接收GAS/APP/ICAM等吞噬相关信号，证明小胶质是脊髓吞噬优势群体。
Single?cell transcriptomics reveals temporal reprogramming of spinal?cord microglial phagocytic function after SNI：GSE246288分时段比对，PID3富集细胞周期与C1qa/b/c；PID7溶酶体生物合成、FcγR吞噬体形成峰值；PID14抗原提呈与TLR（Toll-like receptor）信号强但自噬/溶酶体相对PID7下降，证实吞噬—降解脱钩的时相重编程。
Single-cell transcriptomic analysis reveals functionally distinct heterogeneous subpopulations of microglia：GSE246288分5亚群，Micro3补体/氧化磷酸化强，Micro5细胞因子/TLR强；GSE162807分9簇，Cluster 4细胞周期、Cluster 7内溶酶体重塑与吞噬评分最高，说明炎症调节与吞噬效应两类偏倚程序并存。
Single-cell pseudo-time-series analysis reveals the dynamic mechanisms by which microglia acquire a phagocytic phenotype during their developmental trajectory：以GSE162807建轨迹，Cluster 3似祖态在根端，后期状态phagosome与FcγR吞噬评分升高；分支点BEAM示一臂核糖体生物合成、一臂TNFα/凋亡应激，即共同前体分化为吞噬清除型与促炎型。
Single-cell transcriptomic analysis has identified key genes driving sustained phagocytic activity in microglia：从523个持续上调基因筛得Axl、B2m、Sorl1、Scarb1、Cxcl16、Mbtps1、Mfsd8、Spns1八候选；Axl在伤后早升并维持，Micro1/3/5贡献最大。
In vivo experiments have shown that SNI induces the proliferation and activation of spinal cord microglia in an NP mouse model, accompanied by increased neuroinflammation：SNI小鼠PID3起机械性异常疼痛、冷痛觉过敏；PID14背角c-Fos升高、Iba-1密度增、IL-6/IL-1β与p-p38/p-ERK/p-JNK磷酸化上调，cleaved Caspase-3+细胞逾3倍、Iba-1/cleaved Caspase-3共定位逾6倍，示efferocytosis增强。
In vivo studies have shown that the SNI model induces increased levels of Axl expression in spinal cord microglia, and that inhibition of Axl in the spinal cord can induce pain sensitisation in healthy mice：腰髓qPCR中Axl、Mbtps1、Cxcl16、Mfsd8上调；免疫荧光示SNI背角小胶质Axl逾3倍。鞘内给R428于naive鼠诱发机械性异常疼痛，提示Axl介导efferocytosis是内源性镇痛补偿机制。
In vitro experiments further confirmed that the phagocytic function of microglia in response to apoptotic cells undergoes temporal changes following LPS treatment, and that Axl is involved in regulating microglial phagocytosis：BV2经LPS 1 h/3 h吞噬增强、6 h/12 h下降；R428预处理削弱LPS 1 h吞噬，表明Axl在静息贡献有限、在炎症激活态为关键调节子。
讨论部分总结：研究人员指出NP慢性化不仅由神经元适应驱动，小胶质时序重编程提供框架——急性增殖、吞噬强化、慢性疲劳三阶段；炎症调节与吞噬效应亚群源自共同前体。Axl等八基因构成慢性胶质性适应分子基。抑制Axl破坏保护型efferocytosis致痛敏，故Axl是慢性NP可行靶点。该多组学时空图为阶段特异性干预奠基。
结论翻译：本研究通过多组学整合与体内外验证，系统分析NP进展中脊髓小胶质细胞动态；提出神经损伤后小胶质经历时序功能重编程，吞噬呈阶段依赖双重角色，Axl等关键分子调控之。基于单细胞数据分为三相：PID3急性增殖伴干扰素反应；PID7溶酶体/自噬/FcγR吞噬达峰；PID14吞噬持续但自噬—溶酶体相对回落，吞噬与降解脱钩。鉴定神经炎症调节与吞噬效应两类亚群及八持续上调吞噬基因（含Axl）。Axl在慢性相最显著上调，抑制Axl既致痛敏又损efferocytosis；LPS下吞噬双相。工作首绘NP中小胶质吞噬重编程时空图，凸显Axl为慢性痛潜力治疗靶。
