微流控光散射成像结合深度学习用于淋巴瘤细胞无标记单细胞分类

《Biosensors》：Microfluidic Light-Scattering Imaging Coupled with Deep Learning for Label-Free Single-Cell Classification of Lymphoma Cells

　　

淋巴瘤细胞亚型的准确分类对疾病诊断和治疗决策至关重要，然而传统方法通常依赖荧光标记、繁琐的样品制备和专用仪器，限制了其在快速、无标记单细胞分析中的应用。研究人员提出了一种人工智能辅助的微流控光散射成像平台，用于淋巴瘤细胞的无标记分类。该平台集成了微流控芯片内的水动力聚焦、二维（2D）光散射图案的连续采集、自动化图像预处理，以及基于预训练ResNet50网络的迁移学习，以实现智能光学特征提取与分类。研究采用人B淋巴瘤（Daudi）细胞和人T淋巴母细胞淋巴瘤（SUP-T1）细胞对上述框架进行评估。首先使用标准微球验证光学成像系统，证明在连续流条件下能够可靠采集光散射图案。随后建立了包含800个单细胞散射图案的数据集，并采用分层五折交叉验证进行评估。该框架达到了94.75%的平均分类准确率，受试者工作特征（ROC）曲线的平均曲线下面积（AUC）为0.986。通过将微流控光学生物传感与深度学习相结合，本工作实现了对固有光学散射特征的自动化解读，为快速、无标记淋巴瘤筛查和智能医疗应用提供了一种有前景的人工智能赋能策略。

淋巴瘤是一组起源于淋巴细胞异常增殖和分化的血液恶性肿瘤，具有显著的生物学异质性。准确识别淋巴瘤细胞类型对于早期诊断、疾病分层、治疗决策和预后评估至关重要。当前临床诊断主要依赖组织病理学检查、免疫组织化学、流式细胞术和医学影像，虽然这些技术具有较高诊断准确性，但通常需要繁琐的样品制备、荧光标记、昂贵仪器及经验丰富的人员，难以满足快速、无标记、高通量单细胞分析的需求。因此，发展无需外源标记即可快速表征单个淋巴瘤细胞的光学生物传感技术成为智能医疗诊断的重要目标。

针对上述问题，研究人员开发了一种人工智能辅助的微流控光散射成像平台，将微流控水动力聚焦、二维光散射图案连续采集、自动化图像预处理和基于预训练ResNet50网络的迁移学习集成于一体，用于淋巴瘤细胞的无标记单细胞分类。采用人B淋巴瘤Daudi细胞和人T淋巴母细胞淋巴瘤SUP-T1细胞验证该框架，实验结果表明该平台在连续流条件下可稳定获取高质量光散射图案，并实现94.75%的平均分类准确率和0.986的平均AUC。该研究发表于《Biosensors》，展示了微流控光学传感与深度学习相结合用于无标记淋巴瘤筛查和智能医疗的潜力。

研究方法方面，研究人员首先利用标准二氧化硅（SiO₂）微球和聚苯乙烯（PS）微球验证光学成像系统，随后构建微流控芯片实现水动力聚焦；采用532 nm激光经多模光纤照射，通过20×物镜和互补金属氧化物半导体（CMOS）传感器采集散射图案；开发Python自动化图像处理流程从连续流视频中提取单细胞散射图像；采用ImageNet预训练的ResNet50作为固定特征提取器，结合多层感知机（MLP）分类器进行二分类；通过分层五折交叉验证评估性能。Daudi细胞购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，SUP-T1细胞购自上海青旗生物技术有限公司；标准微球购自中科勒铭科技（北京）有限公司。

### 3.1 微流控光散射成像平台的验证
研究人员采用4 μm SiO₂微球和6 μm PS微球进行验证。通过明场显微图像、静态散射图案、流动散射图案与Mie散射理论模拟图案对比，发现实验获取的散射图案具有与理论预测一致的条纹分布和整体强度轮廓。在方位角φ=90°处提取的角向强度轮廓显示出高度重复性和稳定性；二维快速傅里叶变换（FFT）分析表明连续流成像保留了散射信号的固有空间频率特性。该结果证明平台可在连续流条件下准确、稳定、可重复地采集二维光散射图案，为后续人工智能辅助分类奠定基础。

### 3.2 数据集采集与构建
研究人员将淋巴瘤细胞悬液以500 μL/h注入微流控芯片，以3 mL/h鞘液进行水动力聚焦，以约每秒2个细胞的有效成像速率采集连续视频。通过Python自动化图像处理流程，对视频逐帧进行分解、二值化、高斯滤波、按位反转、孔洞填充、目标分割、裁剪和尺寸归一化，从而提取单个细胞的散射图案。为保障样本独立性，每个细胞轨迹仅选取一个代表性散射图案，并排除并列细胞。最终建立包含800个单细胞散射图案的数据集，其中Daudi和SUP-T1各400个。代表性结果提示，尽管两种淋巴瘤细胞在明场图像中形态相似，其散射分布存在明显差异，表明固有光散射特征可为细胞鉴别提供补充信息。

### 3.3 基于深度学习的淋巴瘤细胞分类
研究人员采用基于ImageNet预训练的ResNet50网络作为固定特征提取器，移除其原始全连接分类层，从每个输入散射图案提取2048维特征，随后使用多层感知机（MLP）分类器进行分类。MLP包含两个全连接层（512和256个神经元），采用线性整流单元（ReLU）激活、dropout和softmax输出；使用Adam优化器，学习率设为1×10^-4，批大小为24，最大训练轮数为100。通过分层五折交叉验证，模型平均分类准确率为94.75%，受试者工作特征（ROC）曲线平均曲线下面积（AUC）为0.986（范围0.981–0.993）。混淆矩阵显示各类别性能均衡，Daudi细胞和SUP-T1细胞的平均精确率、召回率和F1分数均约为94.8%。t分布随机邻域嵌入（t-SNE）可视化显示提取的深层特征形成两个可区分的聚类，虽边界有部分重叠，但大多数样本分离良好，表明网络学习到了与淋巴瘤细胞类型相关的判别性光学散射表征。

讨论部分指出，该平台将微流控与光散射成像结合，实现了连续流条件下单个细胞的稳定检测；相比依赖手工特征提取的传统机器学习方法，迁移学习框架可端到端自动学习层次化特征，简化分析流程并提高适应性。与需要荧光标记的方法不同，该平台无需荧光抗体或分子标记，可直接分析与细胞形态、细胞内结构和折射率分布相关的散射特性。其优势并非在于超越商业流式细胞术的分析能力，而在于无标记光学表型分析，适合初步筛查、研究型细胞表型分析以及需要保持细胞固有特性的应用。研究也存在局限性：目前仅为概念验证，使用两种已建立的细胞系，无法完全反映临床淋巴瘤诊断中的生物学异质性；仅使用二维光散射图案；未来可引入其他光学或生化传感模态，也可探索更新颖的深度学习架构。

研究结论部分：研究人员开发了一种人工智能辅助的微流控光散射成像平台，用于淋巴瘤细胞的无标记单细胞分类。该系统将连续流微流控操作、基于光纤的光激发、二维光散射成像、自动化图像预处理和基于预训练ResNet50网络的迁移学习集成于统一的光学传感框架中。实验验证表明，该平台可在连续流条件下稳定获取高质量光散射图案，并实现对Daudi和SUP-T1淋巴瘤细胞的准确分类，平均准确率为94.75%，平均AUC为0.986。该框架无需荧光标记即可保持高分类性能，突显了人工智能增强光学传感器分析能力的作用。凭借其简便性、自动化和与连续流检测的兼容性，该平台为智能单细胞分析提供了一种有前景的方法；在多种淋巴瘤亚型和临床样本进一步验证后，可为单细胞筛查和表型表征提供补充光学信息，并在临床筛查、疾病诊断、疾病监测和精准医疗等领域具有广阔应用前景。