多功能CMC-纳米氧化石墨烯水凝胶将无荧光团癌细胞成像与抗氧化和抗菌活性相结合

《Pharmaceutics》：Multifunctional CMC–Nanographene Oxide Hydrogels Couple Fluorophore-Free Cancer Cell Imaging with Antioxidant and Antimicrobial Activity

　　

背景：开发可持续生物材料，在不依赖掺入药物或外源性荧光团的条件下，将成像能力与互补生物功能相结合，是构建多功能生物医学平台的一种有吸引力的策略。方法：本研究通过柠檬酸介导交联制备了以纳米氧化石墨烯(nanographene oxide, nGO)增强的羧甲基纤维素(carboxymethyl cellulose, CMC)水凝胶，nGO含量最高达3%（w/w），并评价了其理化、电化学及生物学性质。结果：nGO呈现纳米片形态，水合动力学直径为5.0 ± 0.2 nm，比表面积约为650 m² g^?1。nGO的掺入改变了水凝胶结构，并在所测试的配方窗口内降低了水吸收量。纳米复合水凝胶保持了高细胞相容性，24 h后HeLa细胞活力约为100%。共聚焦显微镜和定量荧光强度分析显示，与未处理细胞相比，荧光信号增强，信号强度约提高八倍，支持了无需外源性荧光探针的荧光辅助HeLa细胞可视化的概念验证。然而，由于仅评估了HeLa细胞且未掺入癌症特异性靶向配体，这些发现并不能确立诊断特异性。CMC–nGO水凝胶还表现出高达96.5%的自由基清除活性，以及对大肠杆菌(Escherichia coli)和白色念珠菌(Candida albicans)的抗菌活性，最大抑菌圈分别为12.9和9.2 mm。此外，nGO的掺入修饰了石墨电极的电化学响应，进一步支持了该平台的多功能特性。结论：总体而言，CMC–nGO水凝胶提供了一种可持续、无药物且无荧光团的生物界面，将荧光辅助细胞可视化与抗氧化、抗菌和电化学功能相结合。未来需要进行进一步的光物理表征、与非癌性宫颈细胞的比较、流变学和力学评价，以及在先进生物模型中的验证，以确立其用于未来生物成像和生物传感应用的潜力。

**多功能CMC–nGO水凝胶：无荧光团成像与抗氧化抗菌性能的集成平台**

宫颈癌仍是全球重大健康负担，其发生主要与高危型人乳头瘤病毒(HPV)持续感染相关。现有的细胞学筛查和HPV检测虽已广泛开展，但受限于可及性、侵入性、成本及特定人群适用性等问题，仍需开发更早期、更易获得的补充策略。同时，越来越多的证据表明，阴道菌群失调、氧化应激和局部炎症与宫颈癌变密切相关，大肠杆菌和白色念珠菌等微生物可能破坏保护性阴道微生态，促进局部微环境恶化。因此，将成像相关功能与生物保护活性相结合的多功能生物材料成为研究热点。水凝胶纳米复合材料因具有水合聚合物网络，可容纳功能性纳米材料并维持良好的细胞-材料相互作用，已在生物医学领域受到广泛关注。氧化石墨烯(GO)和纳米氧化石墨烯(nGO)具备高比表面积、含氧官能团、电化学响应性、本征发光以及抗氧化和抗菌特性，为构建多功能平台提供了理想组分。羧甲基纤维素(CMC)是一种生物相容、可降解的纤维素衍生物，其羟基和羧基有利于交联以及与碳纳米材料的相互作用。尽管已有CMC水凝胶与碳纳米材料的复合体系用于药物递送、生物传感和成像，但能够同时实现荧光辅助细胞可视化、抗氧化和抗菌功能的CMC–nGO水凝胶在宫颈癌相关应用中仍鲜有报道。为此，研究人员假设将nGO掺入柠檬酸交联的CMC水凝胶中，可形成一种本征多功能的生物界面，既能支持HeLa细胞的荧光辅助可视化，又能提供抗氧化和抗菌活性。

研究人员通过柠檬酸介导交联制备了不同nGO含量（0–3% w/w）的CMC–nGO水凝胶，并对其理化、电化学和生物学性能进行了系统评价。关键技术方法包括：扫描电子显微镜(SEM)、傅里叶变换红外光谱(FTIR)、X射线衍射(XRD)、溶胀度和凝胶分数测试；nGO的表征采用透射电子显微镜-能量色散X射线光谱(TEM-EDX)、拉曼光谱、动态光散射(DLS)和Brunauer–Emmett–Teller(BET)比表面积分析；电化学性能通过循环伏安法在石墨电极上评估；生物学评价使用HeLa细胞（ATCC CCL-2?）进行MTT细胞活力测定、共聚焦显微镜成像、DPPH自由基清除实验，以及针对大肠杆菌（ATCC 15597）和白色念珠菌（ATCC 90029）的琼脂扩散抑菌试验。

**3.1 nGO表征**：TEM分析显示nGO呈现高度均匀的纳米片形态，平均片径为2.0 ± 0.2 nm；SEM显示其表面呈皱褶纸状，具有典型的含氧官能团特征；DLS测得水合动力学直径为5.0 ± 0.2 nm，与供应商规格一致；EDX证实主要含碳，同时检测到氧、钠和铝元素；Raman光谱呈现D、G和2D带，表明nGO具有较高的sp²/sp³比例和氧化程度；BET比表面积约为650 m²·g^?1，有利于吸附和扩散。

**3.2 CMC–nGO水凝胶表征**：FTIR结果显示CMC和nGO的特征官能团（–OH、C=O、COO^?等）均存在，谱带强度变化表明nGO成功掺入并与CMC链发生相互作用。SEM观察到nGO在水凝胶中呈分散分布，伴有少量团聚。溶胀和凝胶分数测试显示，pH值显著影响水凝胶的溶胀行为；在pH 5.0–8.0范围内，含nGO的水凝胶（S1–S3）较不含nGO的S0水凝胶表现出更低的水吸收量，而凝胶分数在各组间无显著差异。XRD分析表明，nGO的掺入和热处理导致水凝胶结构非晶化，证实了nGO的整合。电化学测试中，含3% nGO的S3水凝胶修饰石墨电极后，其电流响应显著高于裸石墨电极和仅含CMC-柠檬酸的对照电极，表明nGO改善了电子转移能力。

**3.3 生物学分析**：MTT实验显示，所有水凝胶配方（S0–S3）在24 h暴露后HeLa细胞活力均接近100%，与未处理对照组无显著差异，而Triton X-100阳性对照显著降低了细胞活力，表明水凝胶具有良好的细胞相容性。共聚焦显微镜及定量荧光强度分析表明，经含nGO水凝胶处理后的HeLa细胞荧光信号比未处理细胞增强约八倍，实现了无外源荧光探针的荧光辅助可视化。但研究仅使用了HeLa细胞且未引入靶向配体，因此该结果仅为概念验证，不能证明癌症诊断特异性。

**3.4 CMC–nGO水凝胶的抗氧化活性**：DPPH自由基清除实验显示，S1、S2和S3水凝胶的清除率分别为89.1 ± 0.2%、92.5 ± 0.2%和96.5 ± 0.2%，均显著高于不含nGO的S0（41.0 ± 0.5%），而纯nGO的清除率为91.5 ± 0.3%。结果表明，nGO是抗氧化活性的主要贡献者，且随着nGO浓度的增加，抗氧化性能显著增强。

**3.5 基于nGO水凝胶的抗菌活性**：琼脂扩散实验显示，对大肠杆菌的抑菌圈直径为：阳性对照21.6 ± 0.5 mm，S0为0，纯nGO为5.9 ± 0.4 mm，S1为12.5 ± 0.5 mm，S2为12.3 ± 0.1 mm，S3为12.9 ± 0.8 mm。对白色念珠菌的抑菌圈直径为：阳性对照21.5 ± 1.0 mm，S0为0，纯nGO为4.91 ± 2.00 mm，S1为8.6 ± 0.5 mm，S2为9.0 ± 1.0 mm，S3为9.2 ± 0.9 mm。这些结果表明，nGO的掺入显著增强了水凝胶对两种模式微生物的抗菌活性，其机制可能与nGO表面含氧官能团通过氢键结合微生物细胞壁并诱导物理损伤有关。

**讨论与结论**：讨论部分指出，nGO掺入水凝胶后重新组织了聚合物网络，降低了溶胀度并改变了电化学响应，同时保持了良好的细胞相容性。荧光成像增强信号可能来源于nGO和/或CMC-柠檬酸网络，但由于未进行光致发光光谱、量子产率、荧光寿命等光物理表征，其机理尚不明确。研究缺乏非癌性宫颈细胞对照和靶向配体，因此不能推断诊断特异性。此外，配方开发采用的是单因素逐一法而非质量源于设计(QbD)框架，各因素间的交互作用尚未系统研究。未来需进行光物理表征、与非癌性宫颈细胞（如Ect1/E6E7）比较、流变学和力学性能评价、三维及体内模型验证，以及表面功能化以引入疾病特异性识别配体。研究结论为：本研究确立了柠檬酸交联的CMC–nGO水凝胶作为可持续、无药物且无荧光团的生物材料平台，能够在单一材料中整合光学、生物学和电化学功能。nGO的掺入重组了水凝胶网络，降低了溶胀度，并修饰了电化学响应，同时保持了约100%的HeLa细胞24 h活力。纳米复合水凝胶产生了比未处理细胞高约八倍的本征荧光信号，实现了无外源探针的荧光辅助HeLa细胞可视化概念验证。它们还表现出高达96.5%的自由基清除活性，以及针对大肠杆菌和白色念珠菌的抗菌活性，最大抑菌圈分别为12.9和9.2 mm。该工作的主要创新点在于将荧光辅助细胞成像、抗氧化活性、抗菌性能及电化学响应协同集成了简单的CMC基水凝胶中，且不含任何掺入的药物或常规荧光团。CMC不仅仅是惰性结构基质，还支持和稳定了nGO的功能贡献，从而形成了与宫颈癌相关生物医学应用相关的多功能生物界面。然而，成像结果应视为概念验证而非诊断特异性的证据。该平台的转化需要癌细胞与非癌性宫颈细胞的直接比较、定量光致发光和光稳定性分析、三维及体内模型评估，以及长期生物相容性、 biodegradation、生物分布和免疫反应研究。总体而言，这些发现为未来发展具有本征成像能力和生物保护功能的多功能CMC–nGO生物界面奠定了基础。此外，由于缺乏流变学/力学表征，仅凭目前的溶胀和凝胶分数数据无法推断其体内给药适用性或长期机械稳定性。