来自Acanthostrongylophora ingens（多孔动物门：寻常海绵纲）的Manzamine生物碱的拟议生物合成途径与分子靶点

《Marine Drugs》：Proposed Biosynthesis and Molecular Targets of Manzamine Alkaloids from Acanthostrongylophora ingens (Phylum Porifera: Class Demospongiae)

　　

Manzamine生物碱是一类结构多样的海洋来源生物碱，由于其复杂的多环架构、多样的生物活性和独特的生物合成特征而引起了相当大的关注。印度尼西亚海洋海绵Acanthostrongylophora ingens是这些生物碱的一个特别丰富的来源，为进一步探索其化学多样性、生物合成关系和生物特性提供了机会。研究人员对采自拉贾安帕特（西南巴布亚）、千岛群岛（雅加达特别行政区）、斯佩蒙德群岛（南苏拉威西）和桑吉昂岛（万丹）的海洋海绵Acanthostrongylophora ingens的甲醇提取物经H₂O/EtOAc分配得到的EtOAc层进行了详细的LC-HR-ESI-MS/MS和分子网络（molecular networking）分析。该方法揭示了已知和新的manzamine生物碱及其可能的前体和结构修饰的存在，从而支持了这些生物碱的拟议生物合成起源。此外，纯化了三种柔性细胞毒性manzamine生物碱，即(+)-manzamine A hydrochloride (1)、(+)-manzamine B (2)和(+)-32,33-dihydro-31-hydroxymanzamine A (3)，并通过基于量子力学NMR的计算确定了它们的相对构型，同时经X射线分析验证。(+)-Manzamine A hydrochloride (1)对卤虫（Artemia salina）幼虫（LC₅₀值为0.041 ± 0.012 μM）和HEK293T细胞（IC₅₀值为0.599 ± 0.057 μM）展现出最强的细胞毒性活性。这种强效细胞毒性活性提示了1中azocine环（C32–C33的Z-烯烃）的重要性。随后通过计算方法揭示了1–3的分子机制，确定GSK-3β为潜在靶点。对接结果表明，与其他配体相比，3对GSK-3β具有更好的结合亲和力。所有分离的manzamines (1–3)在结合位点中均保持稳定。研究人员还提出了一种分子机制，以阐明manzamines如何通过特异性靶向GSK-3β来干扰癌细胞。

**Manzamine生物碱的生物合成、立体化学与分子靶点研究解读**

Manzamine生物碱是一类源自海洋的多环生物碱，以其复杂的稠环体系、多样的生物活性以及独特的生源途径而备受关注。海绵Acanthostrongylophora ingens是这类化合物的代表性来源，其体内可积累大量结构多变的manzamine类代谢物。尽管已有研究指出真正生产者可能是共附生放线菌Micromonospora sp.，但迄今仍未鉴定出相应的生物合成基因簇或相关酶，因此manzamine类化合物的生物合成起源尚不明确。此外，这类柔性多环分子的立体化学测定相当困难，传统的波谱方法难以全面确定其相对构型。同时，manzamine A已被证明在多种体外模型中对癌细胞具有抑制作用，并涉及多个分子靶点，但其与GSK-3β等靶点的直接相互作用仍缺乏系统验证。因此，有必要通过高分辨质谱、分子网络、量子化学计算以及计算生物学手段，对来自印度尼西亚不同海域的A. ingens样本进行系统研究，以探索其生物合成路径、确证立体构型并揭示潜在分子靶点。

研究人员所开展的这项研究发表在《Marine Drugs》上。研究团队采集了来自Raja Ampat（西南巴布亚）、千岛群岛（雅加达特别行政区）、Spermonde群岛（南苏拉威西）和Sangiang岛（万丹）四个不同地点的A. ingens样本，首先利用LC-HR-ESI-MS/MS和分子网络分析揭示了其中存在的已知及新manzamine生物碱以及可能的前体分子，从而提出了一个统一的生物合成途径。随后，从千岛群岛的样本中分离纯化得到三种manzamine生物碱，即(+)-manzamine A hydrochloride (1)、(+)-manzamine B (2)和(+)-32,33-dihydro-31-hydroxymanzamine A (3)，并采用基于量子力学NMR计算的方法确定了其相对构型，其中1和2的相对构型还得到单晶X射线衍射的验证。在生物活性测定中，化合物1显示出最强的卤虫致死和HEK293T细胞毒性。进一步利用PASS Targets、GO富集分析和分子对接技术，研究人员鉴定了包括GSK-3β在内的潜在靶点，提出manzamines可能通过ATP竞争性机制抑制GSK-3β活性，从而发挥抗癌作用。这些发现不仅深化了对manzamine类化合物生源途径的认识，也为该类化合物作为抗癌药物先导物的进一步开发提供了理论依据。

在技术方法方面，研究人员利用了多种互补的分析手段。四个不同采集地点的海绵样本经甲醇提取和EtOAc/水分配后，采用LC-HR-ESI-MS/MS进行二级质谱分析，并借助MZmine 4.9.0与GNPS平台构建基于特征的分子网络，以注释已知和未知的代谢物。分离纯化过程采用常规溶剂提取、硅胶柱色谱和高效液相色谱（HPLC）技术。立体化学确证主要依靠DFT NMR计算，具体使用Spartan '24软件进行构象搜索、几何优化和GIAO理论计算，并结合DP4概率分析和X射线衍射数据。生物活性评估涵盖卤虫致死试验、HEK293T细胞MTT试验、琼脂平板扩散抗菌试验和α-葡萄糖苷酶抑制试验。分子靶点识别采用PASS Targets服务器，蛋白-蛋白相互作用与GO富集分析通过STRING数据库完成，分子对接则使用PyRx中的AutoDock Vina引擎实现。

化学分析与生物合成途径方面，LC-HR-ESI-MS/MS和分子网络分析检测到多种与manzamine生物合成相关的前体/中间体，包括3-烷基吡啶类化合物、双(3-烷基吡啶)大环化合物、halicyclamine骨架、色胺以及可能的manzamine B前体等。基于这些证据，研究人员提出了一个从脂肪酸和降亚精胺（norspermidine）出发，经3-烷基吡啶、双(3-烷基吡啶)大环、Diels-Alder环加成、异构化/水解、与色胺的Pictet-Spengler反应以及羟基化/消除等步骤，最终生成manzamine A及其衍生物的统一的生源途径假说。此外，分子网络注释了至少13个相关的结构修饰产物，如8-hydroxymanzamine J、31-hydroxymanzamine A、acantholactam等，其中可能包含多种未知的新结构。

分离与结构鉴定方面，研究人员从千岛群岛采集的海绵样本中分离得到化合物1-3。通过一维和二维NMR、HRMS、比旋光度以及X射线衍射分析，确认了它们的平面结构和构型。DFT NMR计算结果表明，化合物1的最可能立体构型为12S\*, 24R\*, 25R\*, 26R\*, 34R\*（DP4为100%，RMSE为0.94 ppm），化合物2为10R\*, 11S\*, 12R\*, 24S\*, 25R\*, 26R\*（DP4为100%，RMSE为1.58 ppm），化合物3则为12S\*, 24R\*, 25R\*, 26R\*, 31R\*, 34S\*（DP4为99.3%，RMSE为2.16 ppm），并且NMR计算还提出了对1中部分碳信号归属的改进方案。X射线衍射进一步揭示了1和2的立体结构细节，并为该计算方法的可靠性提供了验证。

生物活性评价方面，化合物1对卤虫幼虫显示最强的致死活性，LC₅₀为0.041 ± 0.012 μM，显著优于多种阳性对照；对HEK293T细胞也表现出最强的细胞毒性，IC₅₀为0.599 ± 0.057 μM。构效关系分析显示，azocine环中的Z-烯烃（C32–C33）是1发挥其细胞毒性的重要结构单元。在抗菌试验中，1对金黄色葡萄球菌仅表现出微弱的抑菌圈，对大肠杆菌无抑制作用；2和3在测试浓度下未显示抗菌活性。1还表现出微弱的α-葡萄糖苷酶抑制活性，而2和3在该测试中未显示抑制。

分子靶点与机制方面，PASS Targets预测出PIPK1C、ACVR2B、GSK-3β和CSNK1A1等潜在靶点，其中GSK-3β在GO富集分析中与细胞增殖、凋亡、信号转导等癌症相关生物学过程显著关联。分子对接结果显示，化合物1-3均能稳定结合于GSK-3β的ATP结合口袋，结合亲和力分别为?9.8、?10.4和?10.6 kcal/mol，均强于天然配体（?7.6 kcal/mol），且与关键催化残基如Lys85、Asp200等形成氢键和疏水相互作用。含羟基的2和3因额外氢键而具有稍高的亲和力。这些证据提示manzamines可能通过ATP竞争性机制抑制GSK-3β，进而干扰Wnt等信号通路而发挥抗癌活性。

在讨论部分，研究人员指出分子对接结果与细胞毒性数据属于不同水平的信息，对接只能提示潜在分子机制，不能直接等同于细胞活性；尽管如此，化合物在GSK-3β催化区域内的稳定结合，加上已知的体外抑制证据，支持GSK-3β作为manzamines抗癌作用关键靶点的假说。由于GSK-3β同时参与tau蛋白过度磷酸化和神经退行过程，上述发现也为manzamine类化合物的神经保护潜力提供了解释。

研究结论可概括为：本研究表明来自印度尼西亚四个地区的Acanthostrongylophora ingens是独特的manzamine生物碱的丰富来源。LC-HR-ESI-MS/MS和分子网络分析揭示了已知分子和可能的生物合成中间体，支持了本研究提出的统一的生物合成途径。同时，NMR计算与X射线晶体学相结合，为解析柔性海洋生物碱的立体化学提供了强有力的平台；生物学测定和计算分析确定manzamine A hydrochloride (1)是最具活性的分离产物，并明确GSK-3β是manzamines的一个合理抗癌靶点。总体而言，该研究进一步证实了印度尼西亚海洋海绵作为天然产物发现宝贵生物资源的价值，也凸显了manzamines在生物合成研究以及药理学和基于靶点的药物开发中作为有前景先导化合物的潜力。