超高效液相色谱-串联质谱（UPLC–MS/MS）法开发与验证用于大鼠血浆中恩沙替尼及其主要代谢物M465同步定量并应用于药代动力学研究

《Drug Design, Development and Therapy》：Development and Validation of a UPLC–MS/MS Method for Simultaneous Quantification of Ensartinib and Its Major Metabolite M465 in Rat Plasma and Application to Pharmacokinetic Studies

　　

恩沙替尼（ensartinib）为第二代间变性淋巴瘤激酶（ALK）酪氨酸激酶抑制剂（TKI），用于ALK阳性非小细胞肺癌（NSCLC）。其体内处置与代谢特征，尤其主要代谢物M465尚不完全明确。研究人员旨在开发并验证一种灵敏的超高效液相色谱-串联质谱（UPLC–MS/MS）方法，用于大鼠血浆中恩沙替尼与M465的同步定量，并将该方法用于大鼠药代动力学研究。以克唑替尼（crizotinib）为内标（IS），乙腈一步沉淀蛋白处理血浆；采用Waters Acquity BEH C18柱，以0.1%甲酸水-乙腈梯度洗脱。方法对选择性、线性、下定量限（LLOQ）、精密度、准确度、回收率、基质效应、稳定性、残留与稀释完整性进行验证。恩沙替尼线性0.1–100 ng/mL，M465线性0.05–10 ng/mL，LLOQ分别为0.1 ng/mL与0.05 ng/mL；批内批间精密度2.2%–16.4%，准确度?12.3%至8.0%，均满足生物分析方法验证要求。回收率、基质效应、稳定性、残留及稀释完整性均在可接受范围。大鼠口服恩沙替尼后，恩沙替尼与M465最大血浆浓度（Cmax）分别约64.7 ng/mL与6.3 ng/mL，AUC(0–t)分别为577.6 ng/mL·h与32.5 ng/mL·h，提示M465全身暴露低于母药。研究人员成功建立并验证灵敏、可靠、快速的大鼠血浆恩沙替尼与M465同步测定UPLC–MS/MS方法，并应用于大鼠药代动力学研究，为进一步临床前研究提供分析支撑。

该研究论文发表于《Drug Design, Development and Therapy》。研究背景方面，肺癌为全球癌症死亡首要原因，非小细胞肺癌（NSCLC）中ALK重排占4%–7%。恩沙替尼（ensartinib）为第二代口服ALK酪氨酸激酶抑制剂（ALK-TKI），可穿透血脑屏障，中国已批准其用于ALK阳性晚期或转移性NSCLC一线治疗。恩沙替尼主要经CYP3A4代谢，且对CYP3A4、CYP2C9有强抑制作用；其主要代谢物M465对ALK抑制活性弱，且不抑制CYP酶。已有临床研究提示恩沙替尼与M465均为主要循环成分，但动物模型中同步定量母药与代谢物的方法不足，M465体内形成、暴露与消除特征不清，因此研究人员开展本研究以建立同步定量方法并阐明大鼠体内处置特征。

作者为开展研究采用的关键技术方法包括：以克唑替尼（crizotinib）为内标（IS，internal standard），大鼠血浆经乙腈蛋白沉淀（protein precipitation）处理；色谱采用Waters Acquity BEH C18柱与0.1%甲酸水-乙腈梯度洗脱，质谱为Xevo TQ-S三重四极杆、电喷雾电离（ESI）正离子、多反应监测（MRM）模式；按FDA生物分析方法验证指南验证选择性、线性、下定量限（LLOQ）、精密度、准确度、提取回收率、基质效应、稳定性、残留与稀释完整性；体内研究使用5只雄性Sprague–Dawley（SD）大鼠，禁食12 h后单次灌胃22.5 mg/kg恩沙替尼，尾静脉采血至48 h，非房室模型（NCA）计算药代参数。

研究结果如下。Selectivity：空白血浆、加标血浆与给药后血浆色谱显示恩沙替尼、M465与IS保留时间分别为1.23、1.36、1.16 min，无内源干扰，方法选择性良好。Linearity and LLOQ：恩沙替尼0.1–100 ng/mL回归Y=0.0449172X+0.00735752（r²=0.997），M465 0.05–10 ng/mL回归Y=0.0564485X+0.00355316（r²=0.992），LLOQ分别为0.1 ng/mL与0.05 ng/mL，灵敏度高。Precision and Accuracy：QC样品批内相对标准偏差（RSD）恩沙替尼3.5%–16.4%、M465 2.2%–14.9%，批间RSD恩沙替尼3.2%–13.7%、M465 5.2%–13.9%，相对误差（RE）?12.3%至8.0%，符合FDA标准。Extraction Recovery and Matrix Effect：恩沙替尼提取回收率98.0%–99.6%，M465 96.5%–99.3%；基质效应恩沙替尼92.9%–110.7%，M465 89.3%–91.8%，内源成分对电离无显著影响。Stability：室温3 h、三次冻融、?80°C 21天、进样器10°C 4 h下RE与RSD均在±11.7%内；标准品室温6 h与4°C 24 h稳定。Dilutional Integrity and Carry-Over Studies：5倍与10倍稀释RSD≤3.1%、RE?0.4%至1.9%；ULOQ后空白样无残留峰。Animal Study：恩沙替尼C_max 64.7±14.3 ng/mL、T_max约4.9 h；M465 C_max 6.3±1.7 ng/mL、t_1/2 5.9±2.4 h；M465暴露低，反映母药生成与自身消除平衡，大鼠中并非主要循环贡献者。

讨论部分总结：既往UPLC–MS/MS多聚焦母药，母药与代谢物同步定量面临色谱分离、电离效率不匹配与基质效应干扰；本研究以乙腈蛋白沉淀兼顾简便与高效，按FDA指南全面验证，证实方法稳健。大鼠口服后恩沙替尼中等速度吸收，M465暴露显著低于母药，可能源于转化率有限与代谢物快速消除；临床中M465占总放射活性比例与大鼠不同，提示种属间代谢酶表达差异。动物数据不可直接外推人体，需结合体外代谢与临床药代数据。

结论部分翻译：综上，本研究建立并充分验证一种可同步测定大鼠血浆中恩沙替尼及其主要代谢物M465的UPLC–MS/MS方法，在灵敏度、线性、精密度、准确度与基质效应等方面表现满意。基于该方法在SD大鼠完成药代研究，定量表征母药与主要代谢物体内处置。但体内样本量n=5可能限制统计效能并增加个体变异，未来需扩大样本验证。结果为临床前药代研究提供分析支撑；因潜在种属差异，外推至人类应谨慎，仍需临床研究阐明恩沙替尼与M465的药代行为及临床相关性。