《Journal of Functional Biomaterials》：Cellularized Thermoformed Scaffolds with Human Septal Chondrocytes Support In Vivo Cartilage Maturation for Auricular Reconstruction
编辑推荐：
摘要：基于生物材料的耳再造策略在临床转化中仍受限于若干挑战，包括支架设计、最佳细胞源选择以及新生软骨组织的稳定性。多数近期研究仍依赖动物来源细胞，且未能证明软骨表型的长期维持。方法中，研究人员开发了现货型聚乳酸-聚乙二醇嵌段共聚物（poly(lactide-b
摘要：基于生物材料的耳再造策略在临床转化中仍受限于若干挑战，包括支架设计、最佳细胞源选择以及新生软骨组织的稳定性。多数近期研究仍依赖动物来源细胞，且未能证明软骨表型的长期维持。方法中，研究人员开发了现货型聚乳酸-聚乙二醇嵌段共聚物（poly(lactide-b-ethylene glycol)，PLA-PEG）支架，复合临床级藻酸盐（alginate，Alg），并以人鼻软骨细胞细胞化，用于耳软骨工程。细胞化构建体通过组织学与免疫荧光分析评估细胞外基质生成及质量；并行地，体内植入12周后取回的构建体使用UniVert CellScale测试系统在压缩强度变化上做力学表征；新生组织的软骨形成成熟通过批量RNA转录组学分析评价。结果显示，组织学、免疫荧光与转录组学分析证实稳健的软骨基质沉积，压缩性能改善，并且软骨形成标志物如聚集蛋白聚糖（ACAN）、浅表层蛋白多糖（PRG4）、Ⅱ型胶原α1链（COL2A1）高表达。此外，人特异性Ku80抗体阳性染色确认植入后新生组织中存在人源细胞。结论上，该研究表明PLA-PEG+Alg支架联合人鼻中隔软骨细胞是耳组织工程重建应用中具前景的策略。
《Journal of Functional Biomaterials》刊发的该论文针对耳再造（auricular reconstruction）这一整形外科难题展开研究。当前临床策略主要包括硅胶义耳、合成材料植入体与人自体肋软骨移植。硅胶义耳存在日常摘戴变形问题；多孔高密度聚乙烯（porous high-density polyethylene，pHDPE，商品化MedPore?）虽可单期重建，但术后并发症率约15%，包括排斥、感染与挤出；自体肋软骨作为金标准，却伴随供区 morbidity、需多根肋软骨、耳形不可控等缺陷。组织工程虽自1990年代起即证明“人耳形细胞化支架”可行，但临床转化仍受解剖保真度、支架可降解性、合适细胞源等制约：间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）等在体内成熟差，难以临床落地。因此，研究人员希望用翻译友好型材料与人人源鼻中隔软骨细胞（nasal chondrocytes，NC）构建可体内成熟的耳形构建体，并用转录组学验证成熟状态。
为开展研究，关键技术与样本包括：使用融合丝制造（fused filament fabrication，FFF）制备PLA-PEG方块支架，再以70 °C热成型为健康志愿者CT衍生的耳形模具；细胞源来自鼻中隔与肋软骨患者样本（rhino septoplasty与DIEP flap术中获得），体外比较二者；体内采用免疫缺陷Rag2小鼠异位皮下植入模型，分别植入1×1 cm2方块与耳形热成型构建体，空白对照为无细胞Alg-支架；分析技术涵盖活死染色、组织学（H&E、Toluidine Blue、Verhoeff’s）、免疫荧光（COL2/COL10/Ku80）、批量RNA测序（bulk RNA-seq）与人鼠基因组解歧、qPCR验证，以及UniVert系统压缩力学测试。样本队列上，方块的NC为1.5×10?/块，耳形为18.75×10?细胞/mL，预植入NC pellet作转录组对照。
3.1. Nasal Septum Chondrocytes Demonstrate Increased Capacity of New Matrix Generation In Vitro：研究人员将鼻中隔与肋软骨细胞包埋Alg植入方块支架，24 h活死染色二者活力均高；28天H&E显示仅鼻中隔软骨细胞在Alg内形成细胞外基质（extracellular matrix，ECM）沉积，故选定鼻中隔软骨细胞为最优细胞源。
3.2. Simplified Engineered Inserts In Vivo Model Shows Improved Viscoelastic Properties with Nasal Chondrocytes：方块构建体在Rag2小鼠异位植入12周，宏观上细胞化组呈半透明、有血管化软膜，空白组似钙化发白；力学上，Alg降低Young’s模量，含NC组在高变形区模量更低、黏弹性更似软组织，空白组呈刚性指数增长；H&E见3、6、12周均有软骨形成区，12周最多，说明体内直接成熟可改善工程化组织力学。
3.3. The Refined Ear-Shaped Cellularized Scaffolds in the Ectopic In Vivo Shows That the New Synthetized Tissue Derived Exclusively from Human Cells：耳形支架植入12周后，H&E与Toluidine Blue示全区域软骨形成区与糖胺聚糖（glycosaminoglycans，GAG）沉积；Verhoeff’s见个别样本周边弹性纤维；免疫荧光示Ⅱ型胶原丰富、Ⅹ型胶原缺如（非肥大），人源Ku80阳性证明新生基质主要由人细胞合成。
3.4. Transcriptomic Profiling Indicates a Robust Chondrogenic Maturation of the Synthesized Tissue：耳形样本与预植入NC比，PCA分离明显，1780个差异基因；COL2A1、ACAN、PRG4、COMP、MATN4、ELN等ECM/弹性相关基因上调，肥大与钙化基因不伴上调，MGP抑异位钙化；GO与Reactome示ECM组织、弹性纤维形成通路活跃；PROGENy示TGFβ/WNT高、VEGF/NF-κB/Hypoxia低；qPCR验证SOX9、PTHLH、ACAN、PRG4、COL2A1、COL11A1上调，VEGFA下调，COL1A1转录升但蛋白难检。
讨论部分指出，自体肋软骨虽无排斥但创伤大、依赖术者；MedPore?仅少数合成材料获批且并发症受限推广；本研究用热成型PLA-PEG提供形状支撑、GMP级海藻酸钠水凝胶（hydrogel）载NC，弥补Alg单独力学不足。NC优于肋软骨与小耳畸形软骨（分子层面已证异常）。12周耳形构建体证实人源细胞主导ECM，转录上ELN与MFAP5/MFAP4/EMILIN/FBLN2/BMP7等弹性纤维相关基因激活，但转录上调不足以完成弹性纤维组装，还需转录后与环境力学因素。VEGF低表达契合成熟无血管软骨，利于转化。简化方块力学示低变形由Alg承力、高变形由PLA-PEG承力，细胞化组无须预成熟刺激即改善黏弹性；12周PLA-PEG未降解而Alg降解致耳细部丢失。相较多重材料系统，本平台用简材+人细胞+GMP材料更利监管。
结论部分译文：综上，本研究提出一种结合人鼻中隔软骨细胞与具临床转化潜力材料的耳再造优化制造流程。研究人员确定鼻中隔软骨细胞为最适细胞源，整合入热成型PLA-PEG支架与GMP海藻酸钠水凝胶增强体系中。所得构建体黏弹性提升，体内新ECM合成并适当成熟，经NGS与组织学确认，强化了此类工程化支架作为创伤性或先天性耳缺失替代方案的未来价值。局限在于可见未熟纤维软骨区，未来需明晰软骨时空重塑动力学，并使水凝胶降解率与新基质合成匹配以保耳细部。该平台仍是为无耳症（anotia）治疗提升患者福祉的有前景替代路径。
