倍半萜γ-内酯的抗寄生虫活性及新药物制剂的探索

《International Journal of Molecular Sciences》：Antiparasitic Activity of Sesquiterpene γ-Lactones and the Search for New Pharmaceutical Agents

　　

研究人员开展了一项比较性体外评估，针对24种天然倍半萜γ-内酯（sesquiterpene γ-lactones）及部分半合成衍生物，评估其对三种导致被忽视热带病（neglected tropical diseases, NTDs）的锥虫科（trypanosomatid）寄生虫的活性，即布氏锥虫布氏亚种（Trypanosoma brucei brucei）、克氏锥虫（Trypanosoma cruzi）和亚马逊利什曼原虫（Leishmania amazonensis）。研究人员在不同寄生虫生活史阶段筛选了这些化合物的抗寄生虫活性，并在哺乳动物细胞中评估了其细胞毒性。数种化合物在10 μg/mL浓度下表现出高抑制活性（>95%），包括estafiatin (1)、grossheimin (4)、cynaropicrin (5)、argolide (2)衍生物和arglabin (23)。然而，在较低浓度及细胞内寄生虫模型中，特别是针对T. cruzi和L. amazonensis无鞭毛体（amastigotes）时，活性显著下降。在受试化合物中，dihydroargolide (3)和pulchellin C (19)表现出相对较低的细胞毒性，并进一步评估，其对T. b. brucei的IC₅₀值分别为10.51 ± 1.72 μg/mL和2.51 ± 1.13 μg/mL。针对L. amazonensis前鞭毛体（promastigotes），estafiatin (1)、8α-chloroacetoxygrossheimin (12)和arglabin (23)的IC₅₀值分别为0.16 ± 0.13、0.35 ± 0.18和0.58 ± 0.11 μg/mL，但其选择性指数仍然有限。数据集的比较分析表明，特定结构元件，如α-亚甲基-γ-内酯（α-methylene-γ-lactone）部分及某些取代基（如环氧基和乙酰基），可能以物种依赖性方式影响抗寄生虫活性。同时，普遍较低的选择性指数和细胞内模型中的活性降低突出表明这些化合物作为直接药物先导物的重要局限性。总体而言，这项工作提供了一个系统的比较数据集，并确定了初步的构效关系趋势，可为倍半萜γ-内酯作为抗寄生虫苗头化合物（hit compounds）的进一步化学优化提供指导。

被忽视的热带病（neglected tropical diseases, NTDs）包括人类非洲锥虫病（HAT）、恰加斯病和利什曼病，分别由布氏锥虫布氏亚种（T. b. brucei）、克氏锥虫（T. cruzi）和亚马逊利什曼原虫（L. amazonensis）引起，给全球健康带来沉重负担。现有抗寄生虫药物种类有限，且存在毒性高、疗效不足等问题，因此亟需开发新治疗候选物。天然产物中的倍半萜内酯（sesquiterpene lactones, STLs）具有抗寄生虫活性，但针对多种锥虫科寄生虫的系统性比较研究仍缺乏。该研究发表于《International Journal of Molecular Sciences》，旨在通过统一实验框架，比较24种天然倍半萜γ-内酯及部分半合成衍生物对三种寄生虫不同生活史阶段的活性，并探索初步构效关系，为后续化学优化提供依据。

研究人员利用超临界CO₂萃取、柱色谱和HPLC等方法从哈萨克斯坦植物（如Achillea nobilis、Artemisia glabella、Chartolepis intermedia等）中分离天然STLs，并通过环氧化、Michael加成和酰化等反应合成半合成衍生物。关键技术包括：噻唑蓝（MTT）法测定Vero细胞毒性，XTT法评估RAW巨噬细胞毒性和L. amazonensis前鞭毛体活性；β-半乳糖苷酶报告基因法检测T. cruzi无鞭毛体感染模型；Coulter计数法评估T. b. brucei血流型活性；显微镜计数法测定L. amazonensis无鞭毛体活性。研究还采用GraphPad Prism软件计算IC₅₀和选择性指数（selectivity index, SI）。

结果部分按照论文小标题分述如下：

2.1 对T. b. brucei锥鞭毛体的体外锥虫杀灭活性：在10 μg/mL下，estafiatin (1)和anabasinyl-estafiatin (9)抑制率>99%，但1 μg/mL时1的抑制率（72.91%）比9高13.6倍，而cytisinyl衍生物(8)无活性，提示外亚甲基C₁₁=C₁₃的Michael胺化会降低活性。argolide (2)、grossheimin (4)等也显示>95%抑制。环氧argolide (7)在1 μg/mL抑制99.18%，比母体(2)高9.17倍；8α-氯乙酰氧基grossheimin (12)比grossheimin (4)活性提高11.21倍，表明环氧和乙酰化修饰可增强锥虫杀灭作用。

2.2 对T. cruzi无鞭毛体的体外活性：在10 μg/mL下，多种guaianolide和germacranolide类化合物表现出较高抑制活性，其活性趋势与T. b. brucei类似，但仅基于定性比较，未进行机制验证。

2.3 细胞毒性测定：选取对两种锥虫高活性的13个化合物在Vero细胞上检测，dihydroargolide (3)和pulchellin C (19)细胞存活率>50%，同时分别抑制T. b. brucei 53.42%和64.99%、T. cruzi 80.17%和99.05%。anabasinyl-estafiatin (9)的细胞毒性低于母体(1)，提示Michael加胺可能降低细胞毒性。

2.4 对T. b. brucei和T. cruzi的IC₅₀测定：基于低毒性和可检测活性，选择(3)和(19)构建剂量-反应曲线，(3)对T. b. brucei的IC₅₀为10.51 ± 1.72 μg/mL，(19)为2.51 ± 1.13 μg/mL；对T. cruzi无鞭毛体则分别为7.50 ± 0.23和6.51 ± 0.14 μg/mL。两者SI均低于10，提示需要进一步结构优化。

2.5 对L. amazonensis前鞭毛体的体外活性：10 μg/mL下，(1)、(4)、(5)、(7)、(9)、(12)和(23)完全抑制寄生虫。1 μg/mL时(1)完全抑制，其活性比衍生物(8)和(9)分别高7.4倍和5.75倍；(12)比(4)活性显著增强；(23)在1 μg/mL抑制100%，但对T. b. brucei仅36.54%，显示种间选择性。

2.6 对L. amazonensis前鞭毛体的IC₅₀测定：(1)、(12)和(23)的IC₅₀分别为0.16 ± 0.13、0.35 ± 0.18和0.58 ± 0.11 μg/mL，其中(1)接近两性霉素B（IC₅₀=0.14 ± 0.09），表明其高效力与C₃-C₄α-环氧环及C-8乙酰化有关。

2.7 活性化合物对RAW巨噬细胞的细胞毒性：estafiatin (1)和8α-氯乙酰氧基grossheimin (12)的CC₅₀较低（<2 μg/mL），arglabin (23)为2.50 ± 0.36 μg/mL，grossheimin (4)为4.04 ± 1.40 μg/mL，后者选择性相对较高，但整体SI仍低。

2.8 对L. amazonensis无鞭毛体的体外活性：(1)对无鞭毛体的IC₅₀为0.68 ± 0.007 μg/mL，优于两性霉素B（IC₅₀<0.924 μg/mL）；(23)为1.13 ± 0.006 μg/mL，(4)为6.20 ± 2.46 μg/mL。SI分别为(1)<2.94、(23)=2.22、(4)<1，说明高活性并不能完全代表对胞内无鞭毛体的选择性。

讨论总结指出，STLs的抗寄生虫活性主要归因于α-亚甲基-γ-内酯结构域，其可通过Michael加成与寄生虫的硫醇依赖性氧化还原体系相互作用，导致线粒体功能障碍；estafiatin和arglabin已被报道可干扰硫醇氧化还原稳态。