《International Journal of Molecular Sciences》：Oxidative Stress and Neuroimaging Alterations in Major Depressive Disorder: A Systematic Review
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肝缺血-再灌注损伤（HIRI）不仅是肝移植和重大肝脏手术的常见并发症，也是术后预后的关键决定因素。在HIRI中已观察到乳酸代谢重编程，但乳酸及其相关乳酸化在HIRI发病机制中的作用仍不清楚。为此，研究人员整合了单细胞和bulk RNA测序数据与多种生物信息学方
肝缺血-再灌注损伤（HIRI）不仅是肝移植和重大肝脏手术的常见并发症，也是术后预后的关键决定因素。在HIRI中已观察到乳酸代谢重编程，但乳酸及其相关乳酸化在HIRI发病机制中的作用仍不清楚。为此，研究人员整合了单细胞和bulk RNA测序数据与多种生物信息学方法。应用五种单细胞基因集活性评分方法（AUCell、UCell、singscore、ssGSEA和AddModuleScore）评估各细胞类型的乳酸化活性，随后进行差异表达基因（DEG）分析和高维加权相关网络分析（hdWGCNA）来鉴定乳酸化相关基因。使用五种机器学习算法（随机森林、Boruta、LASSO、GBM和决策树）筛选最佳特征基因，并通过SHAP分析进一步解释其重要性。利用来自基因表达综合数据库（GEO）的bulk RNA测序数据进行验证。此外，使用ChEMBL在线工具筛选NR4A3相关抑制剂，并通过分子对接和分子动力学模拟进行评估。研究人员观察到HIRI中不同细胞类型的乳酸代谢活性存在显著异质性，肝细胞和单核吞噬细胞的活性水平较高。SHAP与机器学习的整合鉴定出PFKFB3、ZYX和NR4A3与HIRI后高乳酸化密切相关，与bulk RNA数据的交叉分析证实它们一致上调。通过Western blotting和RT-qPCR在小鼠肝脏IRI模型中实验验证了候选基因的表达。尽管乳酸化先前已在HIRI中被报道，本研究独特的贡献在于通过多组学整合和机器学习，在单细胞水平揭示了乳酸化相关基因表达的细胞类型异质性。NR4A3、PFKFB3和ZYX作为乳酸化相关调节因子的鉴定，为改善肝移植移植物存活提出了新的治疗靶点。
肝缺血-再灌注损伤（HIRI）是肝移植和重大肝脏手术中的常见并发症，也是影响术后预后的关键因素。其病理机制涉及能量代谢紊乱、氧化应激、炎症反应、线粒体功能障碍等，但分子事件尚未完全阐明。近年来，乳酸化（lactylation，将乳酸分子共价结合至蛋白质赖氨酸残基的翻译后修饰）被发现参与多种器官的缺血再灌注损伤，但在HIRI中的具体作用仍不清楚。因此，这项发表在《International Journal of Molecular Sciences》上的研究，旨在通过多组学整合和机器学习方法，系统探索HIRI中乳酸化相关基因（lactylation-related genes, LRGs）的表达异质性，并筛选潜在治疗靶点。
研究人员主要采用了以下关键技术方法：从GEO数据库获取scRNA-seq数据集GSE171539（每组1例）、bulk RNA-seq训练集GSE12720（移植前/后各21例）和验证集GSE112713（各11例）。使用Seurat处理单细胞数据；应用AUCell、UCell、singscore、ssGSEA和AddModuleScore五种算法评估乳酸化活性；通过hdWGCNA和DEG分析筛选候选基因；结合随机森林、Boruta、LASSO、GBM、决策树五种机器学习算法及SHAP分析确定核心基因；利用CellChat、Monocle2、CytoTRACE分析细胞通讯和轨迹；使用scTenifoldKnk进行虚拟基因敲除；并通过ChEMBL筛选抑制剂，进行分子对接和分子动力学模拟。实验验证采用小鼠70%部分肝缺血再灌注模型，结合Western blotting、RT-qPCR、免疫组化等手段。
研究结果部分包括以下9个方面：
2.1 使用scRNA-Seq分析HIRI中LRGs的复杂性
通过聚类将细胞分为8种类型，乳酸化活性评分显示细胞间存在显著异质性，肝细胞和单核吞噬细胞活性较高；HIRI后内皮细胞、NK/T细胞和单核吞噬细胞的乳酸化评分显著增加。
2.2 通过hdWGCNA鉴定关键基因
构建共表达网络得到7个模块，结合DEG分析最终确定64个与乳酸化相关的hub基因。
2.3 通过多种机器学习算法鉴定核心乳酸化促进基因
五种机器学习算法筛选后取交集，获得NR4A3、PFKFB3和ZYX三个最优特征基因，并在内外部验证中表现稳定。
2.4 SHAP分析结果和bulk水平验证
SHAP分析显示NR4A3贡献最大；在GSE12720和GSE112713中，三个基因均显著上调，AUC值证实其具有良好的诊断效能（NR4A3分别为0.950和0.934，PFKFB3为0.762和0.876，ZYX为0.803和0.868）。
2.5 在单细胞水平验证最优特征基因
PFKFB3和ZYX高表达于单核吞噬细胞，NR4A3表达于单核吞噬细胞和B细胞；进一步亚群分析显示NR4A3和PFKFB3主要表达于巨噬细胞，ZYX表达于单核细胞。
2.6 轨迹分析和细胞相互作用结果
伪时间分析显示NR4A3+巨噬细胞、PFKFB3+巨噬细胞和ZYX+单核细胞的比例随时间保持升高；CytoTRACE提示这些细胞可能处于相对未分化状态；CellChat分析显示NR4A3+巨噬细胞和ZYX+单核细胞具有独特的传出/传入信号模式，涉及LGALS9-CD45、APP-CD74等配体-受体对。
2.7 虚拟NR4A3敲除后的转录组改变
scTenifoldKnk模拟敲除NR4A3导致SESN1、BACH2、BTLA、TCL1A等基因表达显著变化，GO和KEGG富集分析显示这些基因与白细胞细胞-细胞黏附及PI3K-Akt信号通路等相关。
2.8 NR4A3靶向抑制剂和分子动力学验证
ChEMBL筛选出CHEMBL5419098（IC
50 0.69 nM）和CHEMBL5563563（IC
50 3.8 μM），分子对接分数分别为-8.3和-7.9 kcal/mol，分子动力学模拟表明两复合物结合稳定。
2.9 小鼠HIRI模型中整体乳酸化水平和关键LRGs的验证
小鼠HIRI模型显示严重肝损伤、乳酸积累和整体蛋白乳酸化水平升高，RT-qPCR、免疫组化及Western blotting均证实NR4A3、PFKFB3和ZYX在mRNA和蛋白水平表达上调。
讨论部分指出，NR4A3是一种孤儿核受体，参与炎症和代谢调节；PFKFB3是糖酵解关键酶，可调控乳酸生成；ZYX是黏着斑蛋白，参与细胞增殖和凋亡。三者可能通过乳酸化机制促进HIRI中的炎症反应和代谢重编程。细胞通讯分析提示NR4A3+巨噬细胞和ZYX+单核细胞可能通过特定配体-受体对（如LGALS9-CD45、APP-CD74）放大炎症级联反应。同时，研究存在局限性：scRNA-seq缺乏生物学重复、LRG列表源自肿瘤相关文献、抑制剂需进一步实验验证、动物实验仅显示相关性而非因果关系。
结论部分翻译如下：总之，本研究通过转录组学整合与实验验证，确定了NR4A3、PFKFB3和ZYX是驱动肝移植中HIRI的关键LRGs
