HBV pgRNA-m6A水平与HBV复制及肝功能相关

《Epigenetics》：pgRNA-m6A levels associate with HBV replication and liver function

　　

研究人员通过T3 DNA ligase assay测定血清HBV pregenomic RNA（pgRNA）的N6-甲基腺苷（m6A）水平。HBV DNA拷贝数通过TaqMan assay检测，基因表达通过RT-qPCR检测，肝功能通过临床实验室指标评估。研究人员使用Tet-off稳定产HBV细胞系HepAD38及靶向pgRNA去甲基化的SunTag系统（TRADES）进行位点特异性m6A编辑，流式细胞术检测细胞培养上清细胞因子水平。结果显示，血清HBV pgRNA-m6A水平与HBV DNA拷贝数、pgRNA表达及肝功能指标均正相关（全部p<0.05）。在高病毒载量（HBV DNA>1.0×107 IU/mL）患者中，pgRNA-m6A水平与pgRNA表达均显著升高。对pgRNA1907-m6A位点特异性去甲基化可显著降低HBV DNA、乙型肝炎e抗原（HBeAg）与HBV pgRNA，同时诱导干扰素alfa 2（IFN-α2）及载脂蛋白B mRNA编辑酶催化亚基3A（APOBEC3A）表达。研究人员得出结论：HBV pgRNA-m6A修饰与病毒复制及肝功能指标相关，pgRNA位点特异性m6A去甲基化为抗HBV治疗提供新思路。

研究背景方面，慢性乙型肝炎（CHB，chronic hepatitis B）由乙型肝炎病毒（HBV，hepatitis B virus）感染引起，全球约2.96亿人受累，主要并发症为肝硬化与肝细胞癌（HCC，hepatocellular carcinoma）。HBV进入肝细胞后，松弛环状DNA（rcDNA，relaxed circular DNA）入核转化为共价闭合环状DNA（cccDNA，covalently closed环状DNA），cccDNA转录出3.5 kb前基因组RNA（pgRNA，pregenomic RNA），pgRNA经逆转录产生子代rcDNA。已有研究提示RNA表观转录组修饰N⁶-甲基腺苷（m⁶A，N⁶-methyladenosine）可调控病毒RNA代谢与复制，HBV pgRNA的epsilon茎环结构1905—1909位存在保守GGACA基序，A1907为m⁶A甲基化位点，可双向调控pgRNA逆转录与mRNA稳定性。然而，血清中pgRNA-m⁶A是否关联HBV复制与肝功能尚不清楚，也缺乏单碱基分辨率、适用于临床的定量手段，因此研究人员开展本研究。该论文发表于《Epigenetics》。

主要关键技术方法方面，研究人员建立基于T3 DNA ligase assay的pgRNA-m⁶A绝对定量方法，并以1861位腺苷（A）为总RNA参照位点；临床样本为2020—2021年武汉大学中南医院50例HBsAg与HBV DNA阳性、未接受核苷（酸）类似物及聚乙二醇干扰素治疗、无HIV/HCV共感染患者外周血；细胞实验采用Tet-off诱导型产毒细胞系HepAD38与靶向RNA去甲基化SunTag系统（TRADES，targeted RNA demethylation by SunTag system）；位点m⁶A验证用SELECT法；病毒与抗原定量分别用TaqMan assay、RT-qPCR与化学发光免疫分析；上清细胞因子用流式细胞术检测。

研究结果如下。临床特征（Clinical features of participants）：50例含33男17女，平均44±14岁，部分肝酶、蛋白、胆红素异常，提示存在不同程度肝损伤。T3 DNA ligase法的临床应用（Clinical application of T3 DNA ligase-based assay）：研究人员构建pgRNA1907-A与pgRNA1861-A标准曲线，m⁶A位可阻碍探针连接，从而由总RNA减去非甲基化RNA得pgRNA1907-m⁶A浓度；方法在0.6414 pM检出，线性范围0.6414—16.166 pM，稀释样品相关系数0.992。血清pgRNA-m⁶A测定（Measurement of HBV pgRNA-m⁶A levels in serum samples）：高病毒载量组pgRNA-m⁶A高于低载量组；pgRNA-m⁶A与HBV DNA拷贝数（r=0.3465，p=0.0137）、pgRNA表达（r=0.5636，p<0.0001）正相关；pgRNA表达与HBV DNA亦正相关。pgRNA m⁶A修饰与肝功能指标相关（m⁶A modification of pgRNA is associated with liver function indicators）：pgRNA-m⁶A与ALT（r=0.4186）、AST（r=0.3276）、TBIL（r=0.3140）、DBIL（r=0.3416）正相关；多变量回归校正后仍以ALT、AST相关；ALT/AST≥2.5倍上限、AFP升高者pgRNA-m⁶A更高。pgRNA-m⁶A修饰调控免疫应答与HBV复制（pgRNA-m⁶A modification regulates immune response and HBV replication）：TRADES靶向去除pgRNA1907-m⁶A后，pgRNA-m⁶A、pgRNA、总HBV DNA、HBeAg下降，HBsAg不变；APOBEC3A与IFN-α2 mRNA上升，上清IL-6下降，提示m⁶A通过IFN-α2/APOBEC3A通路影响宿主抗病毒免疫。

讨论部分总结：研究人员指出，T3 DNA ligase assay敏感、简便、可绝对定量，适于临床；pgRNA-m⁶A与HBV DNA、pgRNA、ALT/AST及AFP相关，或成抗病毒疗效与停药判断新血清标志物；TRADES证实FTO介导的pgRNA去甲基化以m⁶A依赖方式抑制HBV复制，但无法区分5′/3′ epsilon茎环上1907-m⁶A，且存在潜在脱靶与单中心小样本、未控疾病分期/纤维化/基因型等混杂因素，需长期随访与体内外模型验证。

研究结论部分翻译：本研究中，研究人员首次揭示HBV pgRNA-m⁶A修饰可调控HBV复制，并与肝功能指标密切相关；T3 DNA ligase assay与位点特异性pgRNA-m⁶A去甲基化证明，pgRNA的m⁶A水平反映活跃病毒复制，靶向去除pgRNA1907-m⁶A可抑制pgRNA表达、HBV DNA、HBeAg并增强IFN-α2与APOBEC3A抗病毒应答；血清pgRNA-m⁶A有望作为慢性HBV感染中病毒活性与肝损伤评价的表观转录组标志物，位点在RNA水平的精准编辑为抗HBV治疗提供了新靶点。