《International Journal of Molecular Sciences》：Mechanism Underlying the Color Differences in Apples Based on Metabolomic and Transcriptomic Analyses
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苹果果皮颜色是决定果实品质与消费者偏好的关键性状。为阐明“金红”（JH）苹果与其深色红皮芽变“红金红”（HJH）苹果之间果皮颜色差异的分子基础，研究人员整合生理测定、广泛靶向代谢组学、转录组学及定量实时聚合酶链反应（quantitative real-time
苹果果皮颜色是决定果实品质与消费者偏好的关键性状。为阐明“金红”（JH）苹果与其深色红皮芽变“红金红”（HJH）苹果之间果皮颜色差异的分子基础，研究人员整合生理测定、广泛靶向代谢组学、转录组学及定量实时聚合酶链反应（quantitative real-time PCR，qRT-PCR），分析了果实发育过程中果皮色素含量、代谢物谱及基因表达动态。HJH果皮的深红色表型主要归因于花青素（anthocyanin）积累增强，而非叶绿素含量改变。代谢组学鉴定出418种差异积累代谢物，其中矢车菊素-3-O-(6″-O-丙二酰)葡萄糖苷、矢车菊素-3-O-(2″-O-木糖基)半乳糖苷和矢车菊素-3-O-葡萄糖苷三种矢车菊素型花青素在HJH果皮中显著上调，是深红色泽的关键色素。转录组学检出533个差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs）；结合qRT-PCR验证，花青素合成结构基因MdDFR（二氢黄酮醇还原酶，dihydroflavonol reductase）在HJH果实施关键发育阶段持续高表达，与花青素积累模式高度吻合。综上，MdDFR上调驱动矢车菊素型花青素的特异性积累，是HJH苹果深红色皮的核心分子事件，为苹果着色调控网络提供新见解，并为果实品质遗传改良提供候选基因。
研究背景方面，苹果（Malus domestica Borkh.）为全球重要温带果树，果皮红色程度直接影响商品价值与消费偏好。红色主要源于黄酮类次生代谢物花青素，其中矢车菊素衍生物在苹果皮中占优势。JH苹果由“金冠”（Golden Delicious）与“RALs Janet”杂交而来，抗寒、酸甜平衡，但皮色偏浅红；其天然芽变HJH呈浓烈深红，是解析果色变异的理想材料。目前两品种间驱动深红表型的关键分子事件仍不清楚，因此研究人员以“特定花青物种积累由花青素合成结构基因上调驱动”为假设开展研究。该研究发表于《International Journal of Molecular Sciences》。
主要关键技术方法上，研究人员以黑龙江农科院牡丹江果园中嫁接于Malus baccata砧木的JH与HJH树为样本队列，在盛花后30、60、90、120天取果皮；于90天做广泛靶向代谢组学（液相色谱-电喷雾-串联质谱，LC-ESI-MS/MS）与转录组学（Illumina平台，比对GDDH13 V1.1基因组）；以变量投影重要性（Variable Importance in Projection，VIP）≥1且| Fold Change |≥2筛差异代谢物，以错误发现率（false discovery rate，FDR）<0.05且|log2FC|≥1筛DEGs；并以CTAB法提RNA、Actin为内参做qRT-PCR验证结构基因时序表达。
研究结果如下。2.1 HJH果皮深红表型与花青素积累相关：通过四阶段表型观察与色素定量，发现HJH自30天即与JH分色，120天时HJH均一深红、JH仅浅红；花青素在90与120天显著差异（p<0.05），叶绿素无差异，故深红主要来自花青素富集而非叶绿素降解。2.2 JH与HJH苹果皮色差异的代谢组学分析：90天皮样主成分分析（principal component analysis，PCA）显示PC1+PC2累计72.77%方差，两品种明显分离；以VIP≥1与|log2FC|≥1得418种差异积累代谢物（348上调、70下调）。2.3 主要代谢物分析揭示矢车菊素衍生物为关键差异代谢物：在362种黄酮中检9种花青素；KEGG富集显示花青素合成通路中三种矢车菊素型上调，尤其矢车菊素-3-O-(6″-O-丙二酰)葡萄糖苷（log2FC=2.83，FC=7.11）为最主要呈色物质。2.4 转录组火山图分析：90天转录组获36.17 Gb清洁数据，以|log2FC|≥1且FDR<0.05筛出533个DEGs（209上调、324下调）。2.5 转录组数据GO富集分析：426个DEG归入代谢过程、催化活性、膜等条目，指向黄酮/花青素通量增强与液泡区室化。2.6 转录组数据KEGG富集分析：DEG富集于植物-病原互作、激素信号及花青素合成等通路；通路内筛得MdDFR、MdCHS、MdUFGT、MdF3'H（黄酮3'-羟化酶，flavonoid 3'-hydroxylase）、MdLAR（无色花青素还原酶，leucoanthocyanidin reductase）五结构基因。2.7 转录组与代谢组整合分析：DEG与差异代谢物（differentially accumulated metabolites，DAMs）相关分析显示MdDFR、MdCHS、MdUFGT与三种矢车菊素正关，MdF3'H与MdLAR负关。2.8 qRT-PCR验证DEGs：四阶段表达显示MdCHS与MdF3'H无稳定差异；MdUFGT仅早期差异；MdLAR在JH更高可能分流前体至原花青素；MdDFR自60天起在HJH显著高表达，走势与花青素含量一致，为最可能为限速结构基因。
讨论部分总结中，研究人员指出苹果皮色由花青素、叶绿素、类胡萝卜素协同决定，本文两品种叶绿素无差、色差归因花青素类型与含量；丙二酰化（malonylation）提升矢车菊素-3-O-葡萄糖苷的pH稳定性、抗β-葡萄糖苷酶降解，并增强MATE液泡转运效率，故HJH中矢车菊素-3-O-(6″-O-丙二酰)葡萄糖苷大量积累具呈色与稳色双重意义。DFR是把二氢黄酮醇转无色 leucoanthocyanidin、将流向往有色花青素引流的首个限速酶；MdDFR持续高表达使HJH获得充足前体，与梨、红肉苹果结论一致，但本文结论仍属相关性证据，需瞬时转化或基因编辑做因果验证。MdLAR高表达使JH前体流向原花青素（缩合单宁），解释JH浅红；MdUFGT仅早期差异，非终局主因。
结论部分翻译如下：本研究通过生理生化、代谢组学、转录组学及分子生物学方法，系统阐明JH苹果与其红皮芽变HJH果皮色差机制。HJH深红主要因花青素大量积累而非叶绿素差异。代谢组显示矢车菊素衍生物（尤矢车菊素-3-O-(6″-O-丙二酰)葡萄糖苷）在HJH显著积累，为呈色物质根基。转录组与qRT-PCR表明花青素合成结构基因MdDFR在HJH关键发育期持续高表达，走势与花青素积累高度一致，其余结构基因无稳定差异。综上，MdDFR上调是驱动HJH皮内矢车菊素型花青素特异积累、致深红表型的核心分子事件。研究为苹果果色变异代谢调控网络提供新认识，为果色品质遗传改良提供理论与候选基因。未来应做MdDFR瞬时/稳定转化功能验证、鉴定苹果中矢车菊素糖苷丙二酰转移酶及其转录调控、挖掘调控MdDFR的MYB/bHLH/WD40等上游转录因子、推进标记辅助育种应用。
