《Epigenomics》：A modular class-aware workflow for small RNA sequencing analysis using mouse sperm as a case study
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背景：小RNA（small RNA）测序分析具有挑战性，因为RNA类别在生物发生、序列冗余、基因组组织和注释可靠性方面各不相同。适应这些限制的整合工作流仍然有限，特别是在片段水平和簇水平分析方面。方法：研究人员提出了一种可复现的、容器化的类别感知工作流，以小鼠
背景：小RNA（small RNA）测序分析具有挑战性，因为RNA类别在生物发生、序列冗余、基因组组织和注释可靠性方面各不相同。适应这些限制的整合工作流仍然有限，特别是在片段水平和簇水平分析方面。方法：研究人员提出了一种可复现的、容器化的类别感知工作流，以小鼠精子作为案例研究。该工作流将标准化预处理与互补的注释和定量策略相结合，用于微小RNA（microRNA，miRNA）、转移RNA衍生的小RNA（transfer RNA-derived small RNAs，tsRNAs）、核糖体RNA衍生的小RNA（ribosomal RNA-derived small RNAs，rsRNAs）和PIWI相互作用RNA（PIWI-interacting RNA，piRNA）富集的基因组簇。利用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）暴露雄性小鼠后代的小鼠精子小RNA数据，研究人员比较了整合参考映射、多类别注释、片段水平tsRNA分析和基于基因组的piRNA簇分析，并使用了用于位点感知协调和条件特异性簇分析的自定义模块。结果：整合参考映射比对了88.17%的读数，过滤后保留了690个特征。它识别了LPS与对照组之间的11个差异表达miRNA，而其他类别显示有限信号。片段水平分析提高了tsRNA分辨率。piRNA簇分析确定了958个对照簇和940个LPS簇，其中18个对照特异性簇，没有LPS特异性簇。结论：该工作流支持对小RNA测序数据进行透明、可复现、类别感知的解释，同时强调对从总小RNA测序中获得的piRNA富集信号进行谨慎解释。
小RNA测序分析面临的核心难点在于不同RNA类别在生物发生、序列冗余、基因组组织和注释可靠性上存在本质差异。微小RNA（microRNA，miRNA）和核糖体RNA衍生的小RNA（ribosomal RNA-derived small RNAs，rsRNA）通常可采用基于转录本的定量，而转移RNA衍生的小RNA（transfer RNA-derived small RNAs，tsRNA）因tRNA基因冗余和转录后修饰需要片段级分析，PIWI相互作用RNA（PIWI-interacting RNA，piRNA）则多以基因组簇形式组织。已有工具大多只针对单一类别，缺少兼顾多类别并支持片段水平和簇水平分析的整合流程，导致可复现性和跨类别解释受限。为此，研究人员开发了一种模块化、容器化的类别感知工作流，并以小鼠精子为案例验证，相关论文发表在《Epigenomics》。
该工作流利用来自脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）暴露雄鼠后代的精子小RNA测序数据，结合标准化预处理与互补的注释/定量策略，覆盖miRNA、tsRNA、rsRNA及piRNA富集的基因组簇。通过比较整合参考映射、多类别注释、片段水平tsRNA分析和基于基因组的piRNA簇分析，并加入自定义的位点感知协调与条件特异性簇比较模块，研究实现了跨类别的可复现分析，同时强调对总小RNA测序中piRNA富集信号应作保守解读。
主要技术方法：样本来自父代免疫激活模型（LPS或生理盐水处理）的成年后代小鼠精子，每组5个生物学重复，每个重复由3只雄性小鼠精子混合。流程使用Trim Galore!、FastQC和MultiQC进行质量控制；Rsubread将清洁读数比对至整合参考（miRBase、GtRNAdb、RNAcentral/SILVA/GENCODE），featureCounts生成特征级计数，DESeq2进行差异表达分析；SPORTS进行多类别注释和组成分析；tDRmapper进行片段水平tsRNA定位与分类；proTRAC进行piRNA簇从头预测；自定义模块完成位点感知簇合并、量化及条件特异性非重叠簇比较。此外，利用Kleeman等发表的父代SARS-CoV-2精子小RNA数据对更新版流程进行了外部验证。
基于整合参考的小RNA分析。整合参考映射平均比对了88.17%的读数，低计数过滤后保留690个特征。差异信号集中于miRNA：LPS组相对对照组有11个miRNA差异表达，其中7个上调、4个下调；其他注释类别无显著差异。外部验证中，该流程恢复了已报道的mmu-miR-3471上调，并额外检出mmu-miR-5121下调，说明整合参考可随注释更新增强检测能力。
使用SPORTS进行互补的类别特异性小RNA分析。SPORTS分别对miRNA、tsRNA、rsRNA和Y RNA衍生片段进行定量比较，确认miRNA的差异信号最强，tsRNA变化较温和，rsRNA和Y RNA衍生片段几乎无显著差异。外部验证中SPORTS检出6个差异mi
