综述：糖尿病相关牙周炎中上皮炎症性iNOS–硝酸盐轴通过微小韦荣菌增强牙龈卟啉单胞菌致病性

《International Journal of Molecular Sciences》：Epithelial Inflammatory iNOS–Nitrate Axis Enhances P. gingivalis Pathogenicity via V. parvula in Diabetes-Associated Periodontitis

　　

肿瘤微环境（TME）是一个受神经支配且具有神经化学活性的环境。迄今为止，其胆碱能和GABA能信号 largely 作为独立系统被分析，导致文献中结果不一致。我们提出一个钙门控兴奋性（CAGE）模型，其中α7烟碱型乙酰胆碱受体（nAChR）、α4β2 nAChR、GABA A型（GABAA）和B型（GABAB）受体以及α2δ-1汇聚于单一下游变量：Ca2+通量。α7直接传导Ca2+；α4β2可能将胆碱能输入转向GABA释放；GABAA和GABAB通过细胞内氯离子梯度状态和相反的细胞内信号分支设定钙反应的方向；α2δ-1设定决定去极化是否达到功能阈值的增益。由此产生的钙轴构型，由受体功能状态、氯离子梯度状态、α2δ-1增益和配体暴露所定义，塑造Ca2+输出并约束下游生物学反应。在此框架下，关于乙酰胆碱、尼古丁和GABA的一些分歧性发现成为不同钙调节构型的可检验后果。CAGE产生可检验的预测，包括非线性nAChR剂量-反应曲线、GABAA极性反转、α2δ-1依赖性信号缩放以及空间异质性Ca2+状态。评估nAChR和GABA受体靶向治疗而未事先进行钙轴分层的研究可能并非统计功效不足；它们可能在提出错误的问题。

1. 引言

肿瘤微环境（TME）的复杂性远超癌细胞自身的自主特性，包含免疫与基质成分，通过分泌细胞因子、生长因子及细胞外基质重塑酶共同调节增殖、血管生成和治疗反应。TME同时是神经化学调节的活跃位点，肿瘤神经支配及肿瘤和基质细胞本身提供神经递质，以自分泌和旁分泌方式作用于肿瘤中异常表达的受体。然而，主流研究方式是将每种神经递质系统孤立分析，缺乏将其嵌入共同效应框架的系统性阐述。钙门控兴奋性（CAGE）模型提出，TME内的细胞兴奋性通过神经化学门控Ca²⁺调节来塑造。Ca²⁺作为中心第二信使，整合多种表面输入为特定生物学决策，包括细胞周期激活、细胞骨架重组与迁移，以及通过缺氧诱导因子1α（HIF-1α）和核因子κB（NF-κB）通路表达促血管生成基因。Ca²⁺转导幅度和动力学的紊乱导致增殖表型稳定、侵袭性增加和凋亡抵抗。TME中Ca²⁺内流受电压门控钙通道（VGCCs）、瞬时受体电位（TRP）通道家族、基质相互作用分子（STIM）和Orai蛋白介导的钙库操纵性钙内流（SOCE）以及肌醇1,4,5-三磷酸（IP₃）和兰尼碱受体介导的胞内钙释放调节。胆碱能和GABA能系统特别适合通过直接和偶联机制调节钙稳态。α7 nAChR具有高Ca²⁺通透性，激活磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）、丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶（MAPK/ERK）和Janus激酶/信号转导与转录激活因子（JAK/STAT）通路；异聚体α4β2 nAChR可能构成胆碱能与GABA能通讯的偶联点。GABA_A受体调节膜电位并间接影响电压门控Ca²⁺通道活性，而GABA_B受体通过抑制性G蛋白（G_i/o）直接限制电压门控钙（Cav）2.x通道的Ca²⁺内流。GABA_A效应的方向关键取决于细胞中氯离子梯度的结构。电压门控钙通道α2δ-1亚基（CACNA2D1）不仅作为辅助蛋白，还作为Ca²⁺反应增益的调节因子，决定细胞钙能力，并在多种实体瘤中作为癌症干细胞（CSC）标志物。物理间质环境增加了空间调节层。异常肿瘤血管生成导致间质液压力（IFP）升高、淋巴引流受损，扩散而非对流成为分子运输的主要机制。因此，TME细胞局部分泌的神经递质产生空间异质性暴露场而非均匀配体分布，可能在单个肿瘤内区分不同细胞亚群的钙反应。

2. 肿瘤微环境中Ca²⁺调节的神经化学轴

肿瘤微环境中Ca²⁺调节的经典机制包括VGCCs、TRP家族通道、STIM和Orai蛋白介导的SOCE以及通过IP₃和兰尼碱受体的胞内钙库释放，构成TME的经典钙结构。此外，存在一个部分自主的神经化学层，局部作用的神经递质通过膜电位、离子型受体激活和质膜钙通道可用性调节来调节钙通道活性。乙酰胆碱的来源不仅限于肿瘤浸润神经纤维，许多TME细胞表达非神经元胆碱能系统成分，包括胆碱乙酰转移酶（ChAT）、囊泡乙酰胆碱转运体（VAChT）和胆碱转运体，特别是在内皮细胞和免疫细胞如T淋巴细胞和肿瘤相关巨噬细胞（TAM）中。胆碱能T淋巴细胞是新描述的介导TME内神经系统与免疫反应通讯的群体。GABA能成分同样具有多样化的细胞来源：B淋巴细胞和巨噬细胞可合成和分泌GABA。胆碱能和GABA能信号通过互补途径调节Ca²⁺内流：直接途径为nAChRs特别是α7作为离子通道传导Ca²⁺；间接途径为调节膜电位从而影响VGCC活性；第三部分涉及钙通道本身的可用性，即α2δ-1亚基控制通道向细胞膜的运输及其功能效率。

2.1. 钙结构与转导能力

Ca²⁺动力学重塑是驱动肿瘤进展的最有据可查的机制之一。携带生物学信息的是反应的时空模式，即幅度、持续时间和频率，指定不同的细胞决策。分子水平上，Ca²⁺内流由四个主要系统调节。VGCCs（主要是L型和N型）在多种实体瘤中异常表达，参与mTORC2/AKT依赖性增殖。TRP通道（TRPV1、TRPV4、TRPC1、TRPC5、TRPM2、TRPV6）在不同癌症类型中差异过表达，通过ERK1/2、PI3K/AKT和NF-κB级联调节增殖、迁移、耐药和炎症反应。STIM1-Orai1复合物介导的SOCE是非兴奋细胞包括癌细胞中Ca²⁺内流的主要途径之一。Orai3亚型在前列腺癌和非小细胞肺癌（NSCLC）中常被描述为过表达，与Orai1形成异聚体，减少经典钙释放激活钙（CRAC）电流并增加凋亡抵抗。第四种系统是通过IP₃和兰尼碱受体从内质网（ER）释放Ca²⁺，将表面信号与细胞内离子库偶联。癌症相关成纤维细胞（CAFs）通过L-VGCC、TRPC3和SOCE表现出自身的结构重编程。关键结论是钙通道输出不仅由通道身份决定，还由通道激活的环境条件决定。肿瘤微环境在生理上区别于正常组织，酸性肿瘤微环境由有氧糖酵解和乳酸产生驱动，调节Ca²⁺通透性通道。肿瘤细胞外pH通常报道在约6.5–7.0的酸性范围。神经化学调节Ca²⁺内流需要三个条件：配体可用性、受体表达以及细胞将受体激活转化为改变钙内流的能力。

2.2. 肿瘤微环境中胆碱能对Ca²⁺动力学的调节

TME中胆碱能活性具有两个可分离的钙相关功能：通过α7 nAChR的直接Ca²⁺进入和通过α4β2连接的GABA能调节的潜在信号重定向。在非小细胞肺癌中，A549、H1299和H1975细胞表达胆碱乙酰转移酶（ChAT），使肺癌细胞能够合成和分泌乙酰胆碱（ACh），作为通过烟碱和毒蕈碱乙酰胆碱受体的自分泌生长信号。α7 nAChR作为同源五聚体阳离子通道，对Ca²⁺具有高通透性，P_Ca/P_Na比约10–20。在癌症中，已描述CHRNA7转录物的替代变体，包括人特异性CHRFAM7A重复。由CHRFAM7A编码的截短dupα7亚基本身不形成功能性同源五聚体通道，被描述为显性负调节因子。来自转移性黑色素瘤的最新电生理数据显示，dupα7的效果并非统一显性负性：α7和dupα7亚基可共组装成功能性杂交α7/dupα7通道，其对尼古丁的效力与同源α7 nAChR无显著差异，而对重组SLURP-1的敏感性降低。SLURP-1是内源性自/旁分泌上皮调节因子，作为α7 nAChR的负变构调节剂。在A431表皮样癌细胞中，重组SLURP-1通过α7依赖性机制抑制增殖，在A431异种移植中全身给药抑制原发肿瘤生长和转移进展。SLURP-1可增强低剂量阿霉素在该异种移植系统中的抗肿瘤和抗转移效果。α7 nAChR可参与代谢型细胞内信号传导，延伸至离子型脱敏状态之外。α7激活启动快速Ca²⁺内流，产生可随后被ER次级Ca²⁺释放放大的局部钙微域。α7激活引起膜去极化，可次级开放L型电压门控钙通道。在NSCLC细胞中，暴露于尼古丁或烟草特异性致癌物4-(甲基亚硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮（NNK）导致α7依赖性Ca²⁺浓度增加，激活PI3K/AKT和MAPK/ERK通路。在结直肠癌中，α7激活诱导上皮-间质转化（EMT）。在乳腺癌MCF-7细胞中，α7 nAChR与异源三聚体G蛋白直接偶联，与Gα_i/o和Gα_q的相互作用增强增殖、运动和钙信号传导。α4β2 nAChR主要作为神经递质释放的突触前调节因子，激活GABA能末梢上的α4β2可增加GABA释放。然而，所有关于α4β2介导GABA调节的机制数据均来自神经元制备，尚未在癌细胞或体内TME模型中直接复制。在NNK诱导的肺腺癌模型和NSCLC细胞中，烟碱受体激活同时调节两个对立轴：α7依赖性兴奋性驱动增强和α4β2依赖性GABA调节。慢性尼古丁暴露可增加α4β2表面表达。在NNK诱导的肺和胰腺腺癌模型中，长期暴露与GABA合成酶GAD65抑制和GABA水平降低相关，同时α7和α4 nAChR亚基蛋白表达增加。

2.3. 肿瘤微环境中GABA能调节对Ca²⁺的情境依赖性调节

GABA能信号在癌症中并非简单的兴奋性驱动的抑制对应物。其钙调节效应取决于受体类型、氯离子梯度结构、Ca²⁺通道库和TME细胞组成。GABA_A受体激活根据电化学梯度增加Cl^?电导，经典条件下超极化膜，次级降低电压门控钙通道开放概率。然而，癌细胞中Na⁺-K⁺-2Cl^?共转运体1（NKCC1，由SLC12A2编码）活性增加促进Cl^?在细胞质中积累，使氯离子平衡电位（E_Cl）向更正方向移动，GABA_A受体激活可能变为去极化，次级激活电压门控Ca²⁺通道。在三阴性乳腺癌（TNBC）中，HCC1806和BT-549细胞表现出含β3亚基的表面GABA_A受体表达增加，功能性Cl^?流通过该受体，增殖和迁移直接依赖此轴。GABA_B受体通过两个效应臂作用：G蛋白βγ亚基复合物（Gβγ）分支直接抑制Cav2.1和Cav2.2通道；Gα_i/o途径抑制腺苷酸环化酶，降低cAMP和蛋白激酶A（PKA）活性。在肺癌和结直肠癌中，具有异常谷氨酸脱羧酶1（GAD1）表达的癌细胞将谷氨酰胺转向GABA合成，自分泌分泌GABA，通过GABA_B受体信号使GSK-3β通过抑制性Ser9磷酸化失活，稳定β-catenin，升高cyclin D1，加速增殖。此Ser9事件反映PI3K/AKT活性而非cAMP/PKA臂。GABA能调节也在免疫水平运作：活化的B细胞和浆细胞合成和分泌GABA，促进单核细胞和巨噬细胞向白细胞介素-10阳性（IL-10⁺）抗炎免疫抑制表型分化，抑制CD8阳性（CD8⁺）细胞毒性T淋巴细胞效应功能。肿瘤来源的GABA限制树突细胞和T细胞浸润，部分通过涉及C-C基序趋化因子配体4和5（CCL4/CCL5）的β-catenin驱动轴。

2.4. α2δ-1亚基作为肿瘤微环境中Ca²⁺反应幅度的调节因子

电压门控钙通道的α2δ-1亚基调节Cav1.x（L型）和Cav2.x（特别是Cav2.1和Cav2.2）Ca²⁺通道的可用性和功能能力。α2δ-1增强通道向细胞膜的运输，增加膜表达和功能可用性，增强Ca²⁺内流与效应过程如神经递质释放的偶联。在癌症中，α2δ-1过表达导致功能性Ca²⁺通道向细胞膜募集增加，Ca²⁺内流增强，促增殖活性稳定。在NSCLC中，α2δ-1高细胞亚群表现出通过L型和N型通道的Ca²⁺电流增加，MAPK/ERK通路活性增强，以及癌症干细胞（CSC）特征。高α2δ-1表达细胞在照射后表现出DNA损伤修复效率增加，包括磷酸化组蛋白H2AX（γH2AX）病灶更快解决和共济失调-毛细血管扩张突变（ATM）激酶激活增强。在肝细胞癌（HCC）中，α2δ-1被鉴定为肿瘤起始细胞标志物。α2δ-1过表达是多种实体瘤中反复出现的现象，与预后不良、侵袭性表型和治疗抵抗相关。α2δ-1的药理学调节具有转化意义。普瑞巴林和加巴喷丁通过竞争性拮抗α2δ-1的L-氨基酸结合位点，阻断其与突触衔接蛋白包括血小板反应蛋白和活性区复合物成分的相互作用，损害α2δ-1向突触前活性区的选择性运输。普瑞巴林预期主要作用于肿瘤支配突触末梢中α2δ-1依赖性运输，而非肿瘤细胞总通道库。细胞自主增益的干净测试是遗传性的，即肿瘤细胞中CACNA2D1敲低或过表达。

2.5. 神经化学Ca²⁺调节的流体动力学约束

肿瘤微环境并非配体自由扩散的静态生化空间。实体瘤表现出混乱、可渗透的血管，缺乏适当的周细胞控制，导致大量液体从血管床外渗到间质空间。瘤内淋巴网络功能受损或完全缺失，阻止多余液体引流。净效应是间质液压力（IFP）升高，大幅超过生理值，强烈降低驱动对流的局部梯度，有效均衡间质和血管压力。因此，扩散成为主导但空间受限的分子运输机制。GABA主要通过细胞摄取清除，减少对流直接延长其局部持久性。乙酰胆碱还受乙酰胆碱酯酶（AChE）和丁酰胆碱酯酶（BuChE）的快速酶促水解。在扩散限制清除和AChE/BuChE活性降低的微环境中，ACh可能达到更高更持久的局部浓度。B细胞和巨噬细胞在TME内合成的GABA不会均匀分散，可能在循环受损特别严重的微段内形成局部升高浓度区。单个肿瘤内，暴露于不同α7激活-脱敏模式的微区域可能与α4β2连接或GABA能调节功能突出的区域共存。体外结果，其中配体动力学仅由培养基浓度和自由扩散决定，不太可能准确反映体内发生的条件。

3. 整合模型

CAGE将前述机制整合为TME中神经化学Ca²⁺调节的基于状态的模型。它分配四个角色：α7 nAChR作为多模式促钙输入，α4β2 nAChR作为推定的胆碱能-GABA能偶联节点，GABA_A/GABA_B受体作为方向设定调节因子，α2δ-1作为增益调节因子。Ca²⁺被视为下游整合因子。胆碱能模块定义初始输入：α7提供直接Ca²⁺通透成分，α4β2可能将胆碱能刺激与GABA依赖性调节偶联。GABA能模块塑造钙信号方向：GABA_A取决于氯离子梯度极性，经典GABA_B成分限制Cav2.x依赖性Ca²⁺进入。第三层α2δ-1设定反应增益。空间层增加第四约束：受损引流和扩散主导运输预期产生空间异质且局部持续的ACh和GABA暴露。区分两种主要钙调节状态和一种下游重连条件：促兴奋状态（α7相关促钙信号、高α2δ-1增益、允许性或去极化氯离子处理有利于放大Ca²⁺反应）；缓冲状态（保留GABA能约束和超极化氯离子处理有利于减少或短暂Ca²⁺反应）；重连构型（下游致癌或免疫通路修改近端神经化学Ca²⁺调节预期的生物学后果，GABA_B相关PI3K/AKT-GSK-3β-β-catenin信号提供实验支持示例）。钙调节状态并非肿瘤亚类，而是可能共存于单个肿瘤内的局部且潜在可逆构型。

4. 可证伪的预测

第一，胆碱能刺激与Ca²⁺输出的关系预期联合依赖于激动剂浓度和暴露持续时间。α7和α4β2 nAChR在激动剂敏感性和脱敏行为上不同。第二，TME内胆碱能活性的变化应与局部GABA能张力的变化相关，其方式取决于主导nAChR亚型。第三，GABA对Ca²⁺的效应应根据靶细胞中氯离子转运体状态反转符号：NKCC1活性高且KCC1/KCC3相对功能缺陷的细胞中，GABA_A激活应导致Ca²⁺内流矛盾性增加，而布美他尼药理学抑制NKCC1应恢复GABA_A的超极化从而抗增殖效应。第四，α2δ-1调节应缩放对促钙刺激和去极化线索的Ca²⁺反应，而不改变效应方向。第五，肿瘤内Ca²⁺反应的异质性应部分可映射到神经递质的空间分布，而非仅基因表达差异。

5. 对肿瘤生物学和癌症神经科学的概念性启示

第一个启示是分析单位的变化。相关问题是：给定TME的钙轴谱是什么？乙酰胆碱、尼古丁和GABA的差异效应应针对明确测量的钙轴构型差异进行测试，而非归因于配体身份。第二个启示是物理TME是生物学变量，而非仅背景。配体的空间分布影响细胞暴露于ACh和GABA的持续时间，从而影响Ca²⁺反应的幅度和持久性。体外确定的nAChR和GABA受体配体的IC₅₀和EC₅₀值可能系统性地不同于体内有效浓度。第三个启示涉及治疗分层。靶向α7 nAChR、GABA_A/GABA_B受体或α2δ-1的干预仅能针对靶肿瘤的功能性钙轴谱进行解释。分层至少应包括α7受体组成（包括CHRNA7/CHRFAM7A状态）、α4β2、GABA_A/GABA_B、α2δ-1、NKCC1和Cl^?梯度状态。

6. 局限性与关键验证领域

最显著的局限性是缺乏直接功能数据确认癌细胞或非神经元TME细胞中α4β2和GABA偶联。所有现有描述此机制的数据均来自神经元模型。第二个局限性源于TME异质性：相关成分表达和决定局部神经递质来源的细胞组成在不同癌症类型、疾病阶段和个体肿瘤/肿瘤位点间不同。第三个局限性是缺乏以测试配体梯度效应所需空间分辨率精确测量肿瘤间质空间中神经递质浓度的方法。基因编码神经递质指示剂（GENIs）包括ACh的GACh传感器和GABA的iGABASnFR是最有前景的工具之一。第四个局限性涉及体内选择性药理学调节单个nAChR亚型。现有选择性配体包括α7的PNU-282987和α4β2的沙泽替丁-A在体外模型中表现出足够选择性，但全身应用受CNS受体分布和潜在神经效应限制。

7. 模型总结

模型的价值在于使其假设可实验测试而非保持隐含。围绕单一Ca²⁺效应器组织积累的神经化学证据提供了从碎片化相关性走向可测试、可预测的癌症神经科学的途径。理解钙轴的神经化学构型可能为分子分层和考虑Ca²⁺作为整合效应器的治疗策略提供基础。此转变提出肿瘤微环境的钙调节状态作为比受体或配体身份单独更具信息量的分析单位。

8. 方法论

通过PubMed、Scopus和Web of Science检索相关文献，无出版日期限制。仅查阅开放获取来源。检索词包括肿瘤微环境、钙信号传导、烟碱型乙酰胆碱受体、GABA能信号传导、α2δ-1、CACNA2D1和癌症神经科学。约350篇文章全文阅读，其中159篇保留在最终参考文献列表中。来源选择和评估由作者手动进行，无正式注册方案或自动筛选工具。生成式人工智能（GenAI）未用于文献筛选、来源选择、写作或图形生成。