Darapladib通过抑制脂蛋白相关磷脂酶A2（Lp-PLA2）减轻放射性皮肤损伤及纤维化

《Biomolecules》：Darapladib Ameliorates Radiation-Induced Skin Injury and Fibrosis by Lipoprotein-Associated Phospholipase A2 Inhibition

　　

目前的研究已阐明了放射性皮肤损伤（radiation-induced skin injury，RISI）的机制，并确定了若干减轻其严重程度的医学对策。然而，尚无任何治疗方法被证明能有效预防或逆转放射性皮肤纤维化。本研究表明，放射线可上调脂蛋白相关磷脂酶A2（lipoprotein-associated phospholipase A2，Lp-PLA2）的表达并诱导内皮细胞功能障碍，其特征为DNA损伤反应增强、管形成能力降低及线粒体功能下降。为明确Lp-PLA2在RISI进展中的作用，研究人员用选择性Lp-PLA2抑制剂darapladib处理人真皮微血管内皮细胞和SKH1无毛小鼠皮肤。在内皮细胞中，darapladib减轻了辐射诱导的细胞损伤，并抑制了内皮-间质转化（endothelial-to-mesenchymal transition，EndoMT）。在受照射小鼠皮肤中，darapladib减轻了辐射诱导的炎症、脂肪组织破坏、真皮增厚和皮肤纤维化。值得注意的是，darapladib调节了巨噬细胞极化，并抑制了受照射皮肤中辐射诱导的巨噬细胞浸润。这些发现提示，抑制Lp-PLA2可能为治疗RISI及其他纤维化皮肤病揭示潜在靶点。

**放射性皮肤损伤与纤维化的抗纤维化治疗新策略：Lp-PLA2抑制剂Darapladib的作用机制研究**

放射治疗（radiotherapy，RT）是多种恶性肿瘤治疗中不可或缺的手段，但它在杀灭肿瘤的同时也会损伤正常组织，导致急性和慢性副作用。皮肤和血管等软组织在放疗后常发生纤维化，这是由严重组织损伤后持续且失调的伤口愈合反应所驱动的过程，以肌成纤维细胞（myofibroblast）的积累为特征。肌成纤维细胞产生过量细胞外基质（extracellular matrix，ECM）蛋白，包括I型胶原和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA），导致结缔组织异常沉积和器官功能障碍。内皮细胞则通过内皮-间质转化（EndoMT）成为肌成纤维细胞的来源之一，并伴随微血管稀疏化。转化生长因子-β（TGF-β）在纤维化的起始和进展中发挥核心作用。尽管已有多种针对细胞因子、趋化因子、基质金属蛋白酶及抗氧化剂的治疗策略被提出，但目前仍无临床有效的放射性纤维化治疗方法，相关研究亟待开展。

Lp-PLA2是一种Ca²⁺非依赖性分泌型磷脂酶A2，主要由巨噬细胞、肥大细胞等炎症细胞以及内皮细胞合成释放。其酶活性可产生溶血磷脂酰胆碱（lysophosphatidylcholine，LPC）和氧化脂肪酸等促炎介质。辐射暴露可上调Lp-PLA2表达，并与放射性炎症和内皮功能障碍相关。Darapladib是Lp-PLA2的选择性强效口服抑制剂，已在动脉粥样硬化患者的III期临床试验中完成评估，近期还在糖尿病性黄斑水肿和阿尔茨海默病中显示出治疗潜力，但其对放射性皮肤损伤（RISI）的作用尚不清楚。基于此，研究人员利用内皮细胞、成纤维细胞、巨噬细胞及SKH1无毛小鼠模型，系统探讨了Darapladib在辐射诱导的内皮损伤、炎症和纤维化中的作用及机制。研究结果表明，Darapladib可通过抑制Lp-PLA2减轻辐射诱导的细胞损伤和纤维化，为RISI的临床治疗提供了新靶点和候选药物。该论文发表在《Biomolecules》期刊。

**主要技术方法**：该研究采用SKH1无毛小鼠（购自韩国Dooyeol Biotech公司）建立放射性皮肤损伤模型，给予两次20 Gy局部照射并皮下注射Darapladib（20或40 mg/kg）；从C57BL/6小鼠骨髓分离培养骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）。体外使用人真皮微血管内皮细胞（HDMVECs）和人真皮成纤维细胞（HDFs），通过siRNA转染敲低Lp-PLA2。主要技术包括Matrigel管形成实验、JC-1线粒体膜电位检测、γ-H2AX免疫荧光、Western blotting、实时荧光定量PCR、ELISA、流式细胞术、H&E与Masson三色染色、免疫组化（IHC）、UPLC-ESI-QTOF质谱分析，以及Corneometer、Tewameter和pH计测量皮肤屏障功能。

**3.1 Lp-PLA2 Inhibition by Darapladib Ameliorates Radiation-Induced Endothelial Cell Damage（Darapladib通过抑制Lp-PLA2改善辐射诱导的内皮细胞损伤）**：实验发现，Darapladib预处理可显著抑制辐射诱导的Lp-PLA2 mRNA表达，降低氧化型低密度脂蛋白（oxLDL）水平和细胞内活性氧（ROS）。同时，Darapladib减少了γ-H2AX焦点形成，恢复了内皮细胞在Matrigel上的管形成能力，并通过JC-1探针证实其恢复了辐射损伤后的线粒体膜电位，表明Darapladib可在细胞水平保护内皮功能。

**3.2 Lp-PLA2 Regulates Radiation-Induced Transdifferentiation（Lp-PLA2调控辐射诱导的转分化）**：Lp-PLA2 siRNA敲低可抑制辐射诱导的LPC产生。辐射使HDMVECs中内皮标志物CD31表达降低，而α-SMA、Snail和Vimentin等成纤维细胞标志物升高；Lp-PLA2抑制则可逆转这些表型变化，提示EndoMT受Lp-PLA2调控。成纤维细胞经辐射后产生多种LPC亚型，外源性LPC（18:0）处理可诱导成纤维细胞-肌成纤维细胞转化（FMT）、应激纤维形成及胶原表达增加；Darapladib处理则降低了FMT标志物表达，表明Lp-PLA2抑制可同时限制EndoMT和FMT。

**3.3 Darapladib Inhibits Radiation-Induced Skin Injury and Restores Barrier Integrity（Darapladib抑制放射性皮肤损伤并恢复屏障完整性）**：在SKH1小鼠模型中，辐射诱导皮肤Lp-PLA2表达增加和明显瘢痕形成，而40 mg/kg Darapladib几乎完全消除可见瘢痕。Darapladib剂量依赖性地恢复了皮肤水合度，降低了经表皮水丢失（TEWL），并将辐射升高的皮肤pH（7–8）恢复至接近对照水平（5–6），表明其可有效恢复皮肤屏障功能。

**3.4 Darapladib Attenuates Radiation-Induced Skin Fibrosis（Darapladib减轻放射性皮肤纤维化）**：组织学分析显示，Darapladib保持了角质层完整性，降低了辐射引起的表皮和真皮厚度增加，恢复了真皮白色脂肪组织（DWAT）中的脂肪细胞数量与面积，并剂量依赖性减少胶原沉积。PLIN-1免疫荧光证实Darapladib恢复了辐射耗竭的脂质成分，进一步验证了其抗纤维化作用。

**3.5 Darapladib Suppresses TGF-β Signaling in Radiation-Induced Skin Fibrosis In Vivo（Darapladib在体内抑制放射性皮肤纤维化中的TGF-β信号）**：Western blotting显示Darapladib降低了TGF-β受体蛋白水平，抑制了辐射诱导的α-SMA和Vimentin表达升高；ELISA证实Darapladib减弱了辐射诱导的TGF-β上调。免疫组化进一步显示，Darapladib显著减少DWAT周围α-SMA表达及表皮中Vimentin积累，提示其通过抑制TGF-β信号和EndoMT发挥抗纤维化作用。

**3.6 Darapladib Reduces Inflammatory Cell Infiltration and Regulates Macrophage Polarization（Darapladib减少炎症细胞浸润并调节巨噬细胞极化）**：Darapladib显著降低了辐射皮肤中IL-6、IL-1β和TNF-α的mRNA表达，并减少了诱导型一氧化氮合酶（iNOS）阳性细胞的浸润。流式细胞术分析显示，Darapladib减少了CD11b⁺Ly6C^high炎症性巨噬细胞以及M1（CD80⁺）和M2（CD206⁺）巨噬细胞的比例。BMDM体外极化实验进一步证实，Darapladib可直接降低LPC诱导的M1和M2极化标志物表达。

**讨论与结论**：讨论部分指出，放疗后中重度皮肤反应的发生率高达95%，但有效的治疗和预防策略仍然有限。纤维化的发展取决于巨噬细胞极化模式和炎症刺激的持续存在：经典活化的M1巨噬细胞通过iNOS途径释放促炎细胞因子，加剧组织损伤并促进肌成纤维细胞形成；M2巨噬细胞则通过分泌TGF-β等促纤维化介质在伤口愈合的修复期发挥促纤维化作用。Darapladib通过减少LPC产生、降低TGF-β表达来逆转EndoMT和FMT，并通过直接调节M1/M2极化来抑制纤维化进展。结论部分表明，Darapladib通过抑制LPC产生、减少ROS生成、抑制胶原沉积并逆转肌成纤维细胞活化，在皮肤中发挥抗纤维化作用；同时通过抑制M1巨噬细胞活化减轻早期炎症反应，并在损伤后期抑制持续的M2巨噬细胞过度活化。因此，Darapladib有望成为放疗后皮炎和皮肤纤维化患者的一种有前景的治疗选择。该研究成果已在韩国知识产权部注册专利（10-2891833）。