胡蜂科毒液来源抗菌肽HT-2-1-3对变异链球菌UA159的杀菌及抗生物膜活性

《Antibiotics》：Bactericidal and Antibiofilm Activities of HT-2-1-3, a Vespidae Venom-Derived Antimicrobial Peptide, Against Streptococcus mutans UA159

　　

背景：牙齿龋病是一种与生物膜相关的疾病，其中变异链球菌（Streptococcus mutans）发挥核心作用。本研究评估了胡蜂科（Vespidae）毒液来源的抗菌肽（antimicrobial peptide，AMP）HT-2-1-3作为潜在局部防龋先导物的价值。方法：候选肽通过Fmoc固相肽合成制备，并以反相高效液相色谱（RP-HPLC）和电喷雾电离质谱（ESI-MS）进行表征。针对变异链球菌UA159的抗菌活性通过最低抑菌浓度（MIC）、最低杀菌浓度（MBC）、生长曲线和时间-杀菌（time-kill）实验评估。进一步评价了膜损伤、抗生物膜活性、细胞相容性、溶血性和小鼠初步口腔安全性。结果：HT-2-1-3在受试肽中活性最强，MIC和MBC均为2 μg/mL。它以浓度依赖方式抑制细菌生长，并在4×MIC（8 μg/mL）下2 h内实现完全杀菌。机制实验显示快速膜去极化、碘化丙啶（PI）摄取增加，以及细胞外DNA和蛋白的浓度依赖性释放。分子动力学（MD）模拟表明HT-2-1-3在1857 ns进入变异链球菌UA159模型膜，支持膜透化是其杀菌活性的中心环节。扫描电镜显示剂量依赖性膜破坏、细胞塌陷和破裂。HT-2-1-3抑制约58–63%生物膜形成，并清除多达89.0%成熟生物膜。在高达64×MIC（128 μg/mL）浓度下溶血低于4%，在高达16×MIC（32 μg/mL）浓度下哺乳动物细胞存活率超过95%。小鼠重复口服给药未引起明显牙龈刺激。结论：HT-2-1-3对变异链球菌UA159具有强杀菌和抗生物膜活性及良好初步生物相容性，其作用方式可能涉及膜破坏，并显示出有利的初步生物安全性，支持将其进一步优化为用于龋病预防和控制的局部抗菌候选物。

研究背景方面，牙齿龋病是全球最常见的慢性非传染性疾病之一，当牙菌斑向产酸、耐酸微生物群落转变并促进釉质脱矿时发病。变异链球菌是主要致龋菌种，可把膳食碳水化合物代谢为有机酸、合成胞外多糖（extracellular polysaccharides，EPS）并在牙面形成结构化生物膜。EPS丰富基质使酸滞留于釉质附近并阻碍抗菌物渗透，使成熟牙菌斑难以清除。现有菌斑控制依赖机械清洁、氟化物和氯己定等局部抗菌剂，但长期或非选择性抗菌暴露可导致牙齿着色、味觉障碍、黏膜刺激及口腔微生态紊乱，加之对抗菌药物耐药性的关注，作用机制不同于传统抗生素的抗感染剂受到重视。抗菌肽常带正电荷并形成两亲结构，可通过与带负电细菌膜相互作用破坏膜完整性，有望降低经典靶点耐药风险。胡蜂科毒液含多种生物活性肽，是发现膜活性抗菌分子的有用来源。因此，研究人员从内部胡蜂科毒液来源抗菌肽数据库筛选候选肽，评价其对变异链球菌浮游菌和成熟生物膜的活性及初步安全性，判断其是否可作为局部防龋先导物。

该论文发表于《Antibiotics》。

主要关键技术方法方面，研究人员从内部胡蜂科毒液来源抗菌肽数据库依理化描述和预测抗菌潜力筛选候选肽；以Fmoc固相肽合成制备肽，用RP-HPLC和ESI-MS表征；以 broth microdilution 测定MIC与MBC，用OD₆₀₀生长曲线和time-kill评估杀菌动力学；用圆二色（CD）光谱分析二级结构；用DiSC₃(5)膜电位探针和PI摄取评价膜功能；用MD模拟（CHARMM36m力场、POPE:POPG=3:1模型膜）研究肽-膜相互作用；用扫描电镜观察形态；用结晶紫和MTT评价生物膜；用小鼠红细胞溶血、巨噬细胞CCK-8及4周龄雌性ICR小鼠（n=3/组）30天局部口服处理做初步体内安全评估。

研究结果如下。

肽合成与结构表征：研究人员合成HT-2-1-3、HT-2-1-4、HT-2-1-6并纯化鉴定，RP-HPLC呈单峰且纯度>95%，ESI-MS确认HT-2-1-3实测分子量1938.46 Da，AlphaFold3预测其呈紧凑α-螺旋构象，序列比对显示其与代表性胡蜂科抗菌肽整体一致性仅17.6–33.3%。结论为该肽在所选比较物中一级序列独特。

抗变异链球菌活性：三肽均抑制UA159，HT-2-1-3的MIC和MBC均为2 μg/mL，MBC/MIC=1，归为杀菌性；聚维菌素B在本体系MIC=10 μg/mL作阳性对照，氯己定MIC>20 μg/mL。结论为HT-2-1-3杀菌活性最强。

生长抑制与杀菌动力学：生长曲线显示≥2×MIC时OD₆₀₀几乎不变，1×MIC仅延迟生长；time-kill中8×MIC（16 μg/mL）1.5 h降至检测限以下，4×MIC（8 μg/mL）2 h完全杀菌，2×MIC出现暂时抑制后部分恢复。结论为持续清除指数期菌需高于MIC的暴露。

圆二色结构表征：水中以200 nm附近负信号为主，呈无规卷曲；SDS膜模拟环境中208和222 nm负极小、190–195 nm正极大，呈α-螺旋。结论为HT-2-1-3在膜模拟环境发生无规卷曲到α-螺旋转变，利于细菌膜相互作用。

膜去极化与PI摄取：DiSC₃(5)荧光迅速升高且随浓度上升，PI荧光也迅速升高并维持。结论为HT-2-1-3快速破坏UA159膜电位稳态和屏障功能。

DNA与蛋白泄漏：胞外DNA和蛋白随肽浓度升高而增加，聚维菌素B对照组亦明显泄漏。结论为HT-2-1-3损害膜完整性并释放细胞内成分。

分子动力学分析：2000 ns模拟中脂质RMSD稳定，肽骨架RMSD呈现稳定化，肽在1857 ns进入UA159模型膜，促进膜透化和去极化。结论为模拟与泄漏及荧光实验一致，膜透化是杀菌重要环节，但模拟不能建立完整分子路径或排除细胞内效应。

膜破坏形态学：扫描电镜示未处理菌球形完整；4×MIC表面凹陷皱缩；64×MIC大量塌陷破裂并内容物漏出。结论为膜损伤促成快速杀菌。

生物膜抑制与清除：结晶紫示4、8、16 μg/mL形成抑制率60.3%、62.7%、58.2%，聚维菌素B为53.0%；MTT呈非单调反应，16 μg/mL代谢抑制最强；48 h成熟生物膜在4、8、16 μg/mL清除率67.4%、86.0%、89.0%，16 μg/mL与聚维菌素B（85.9%）相当。结论为HT-2-1-3抑制早期形成并减少成熟生物膜生物量。

体外与体内生物安全：溶血至64×MIC仍<4%，HC₅₀>128 μg/mL；哺乳动物细胞至16×MIC存活>95%，CC₅₀为101.9 μg/mL，选择性指数CC₅₀/MIC=51.0；小鼠经MIC和2×MIC局部口服30天，下颌H&E切片未见溃疡、广泛坏死或显著炎细胞浸润。结论为在抗菌浓度范围与宿主毒性间存在初步安全窗。

讨论部分总结：研究人员指出，HT-2-1-3兼具杀浮游菌、抑生物膜、减成熟生物膜和低宿主毒性的早期要求；其MIC/MBC=2 μg/mL且超MIC快速杀菌，与阳离子两亲性抗菌肽膜破坏范式一致。成熟生物膜受EPS和eDNA保护，该肽仍达约89%清除，说明具潜在防龋价值；MTT非单调反应原因未明，可能涉聚集、溶解度或 Assay 特异性，但原文未下结论。相较多重功能肽系统，HT-2-1-3是更简单的抗菌先导，后续需配方改善口腔滞留、蛋白酶稳定性、pH响应和牙面亲和性。安全上，口腔有唾液流、蛋白水解酶、酸攻击和共生菌等未被全复现，需上皮细胞和龈成纤维细胞、重复剂量病理及炎症标志物评估。局限包括仅用UA159标准株、未做多物种菌斑、未知对共生菌影响、未测模拟唾液稳定性，以及小鼠每组n=3仅为定性初步。该肽应被视为天然产物来源抗菌先导而非成品疗法。

结论部分翻译：HT-2-1-3是一种胡蜂科毒液来源的抗菌肽，在本题外实验中针对变异链球菌UA159表现出杀菌和抗生物膜活性。它在低溶血和有限细胞毒性的浓度下快速降低细菌活力、抑制生物膜形成并减少成熟生物膜生物量。膜去极化、碘化丙啶摄取、细胞外DNA和蛋白泄漏、扫描电镜改变以及分子动力学模拟共同支持膜破坏是其抗菌活性的主要贡献者。在小鼠初步口腔安全评估中，重复局部给药未引起明显局部组织损伤。这些发现将HT-2-1-3确定为用于局部龋病控制策略的有前景先导物。其转化潜力应通过使用临床分离株和多物种口腔生物膜、评估对共生微生物群影响、耐药性发展、在唾液和酸性环境中稳定性，以及改善口腔滞留的制剂来进一步评价。