NEKfla：一种用于活细胞监测早期NIMA相关激酶7–NLRP3家族pyrin结构域包含3（NLRP3）炎症小体信号的可基因编码F?rster共振能量转移生物传感器

《BIOMATERIALS RESEARCH》：NEKfla: A Genetically Encoded F?rster Resonance Energy Transfer Biosensor for Live-Cell Monitoring of Early NIMA-Related Kinase 7–NLR Family Pyrin Domain Containing 3 Inflammasome Signaling

　　

NLRP3炎症小体是炎症反应的关键调节因子，并日益被认为是多种化学、生物及微环境刺激病理反应的重要介质。然而，目前大多数可用方法主要检测下游或终末事件，限制了对炎症小体组装前早期分子过程的实时分析。研究人员报道了NEKfla，一种可基因编码的F?rster共振能量转移（FRET）生物传感器，用于在活细胞中对早期NEK7–NLRP3相关信号进行单细胞质时空分辨率监测。NEKfla使用连接于ECFP–YPet FRET对的全长NEK7和NLRP3构建，并生成ΔLRR对照传感器以评估相互作用依赖的反应。在活细胞和体外分析中，NEKfla检测到脂多糖（LPS）和nigericin诱导的刺激依赖性FRET增加，对MCC950和licochalcone B的药理抑制产生响应，并可视化与NLRP3寡聚化相关的动态变化。该生物传感器在巨噬细胞样细胞等多种细胞背景下发挥作用，并且比caspase-1报告器更早检测信号变化。这些发现确立NEKfla作为追踪近端炎症小体激活事件的活细胞平台，并支持其在机制研究及调控早期NLRP3炎症小体信号的材料或化合物基于细胞筛选中的潜在用途。

研究背景方面，炎症是防御感染和损伤的关键宿主反应，但持续或失调的炎症信号参与炎症性肠病、类风湿关节炎、克罗恩病及脑炎性疾病等多种人类疾病。细胞焦亡（pyroptosis）与炎症小体激活是炎症病理的核心机制。经典炎症小体激活通常分为启动（priming）与激活（activation）两步：启动阶段由病原体相关分子模式（PAMP）、损伤相关分子模式（DAMP）及细胞因子诱导炎症小体组分与炎症因子表达；激活阶段模式识别受体组装为寡聚复合物，招募凋亡相关斑点样蛋白（ASC）并形成ASC丝状结构，促进pro-caspase-1招募与激活，继而成熟IL-1β等炎症因子并剪切gasdermin D形成膜孔。NLRP3炎症小体因可响应病毒、细菌、真菌及无菌应激如离子流、溶酶体损伤、活性氧而备受关注。现存方法多依赖终点或下游读数，如ASC speck、caspase-1激活报告系统，难以解析组装前的近端分子事件。NEK7（NIMA-related kinase 7）结合NLRP3的leucine-rich repeat（LRR）结构域，是经典NLRP3通路特有且必需的早期事件，因此成为监测早期信号的理想界面。该研究由研究人员在《BIOMATERIALS RESEARCH》发表，旨在构建可实时报告NEK7–NLRP3关联信号的活细胞平台。

主要关键技术方法方面，研究人员使用HepG2、HEK293A、U87MG及Raw 264.7细胞系，并构建FPR1敲除U87MG细胞模型；采用基于ECFP与YPet的单分子FRET生物传感器设计及ΔLRR对照；通过体外荧光分光光度法测定522/480 nm发射比；利用活细胞显微镜进行FRET/ECFP比值成像与亚细胞共定位分析，以Pearson相关系数评估与线粒体、内质网及反式高尔基体网络（TGN）的关系；以单多肽FPX caspase-1生物传感器作为下游比较读数；通过影像量化puncta数量与胞质/寡聚区室信号。样本无临床队列，仅为上述培养细胞模型。

研究结果如下。

Development and in vitro validation of a NEK7–NLRP3 FRET biosensor：研究人员在HEK293A中验证NEK7促进NLRP3寡聚，nigericin（Nig）剂量依赖增强该效应，MCC950与licochalcone B（Lico B）抑制寡聚；体外裂解液光谱显示Nig升高522 nm发射，抑制剂降低522/480 nm比，证明NEKfla可报告治疗依赖性早期NEK7–NLRP3信号。

Subcellular localization and functional dynamics of NEKfla：在HepG2中，NEKfla呈胞质弥漫与puncta，ΔLRR主要为弥漫态；puncta区FRET/ECFP比高于胞质，ΔLRR均低。NEKfla puncta与TGN标记Pearson r=0.84，优于线粒体r=0.19与内质网r=0.21；LPS与Nig增加puncta数，表明炎症刺激使NEKfla由弥漫转向局部高比结构，动态反映早期NLRP3信号。

Functional characterization and sensitivity validation of NEKfla：活细胞中LPS或Nig使FRET/ECFP比逐渐升高，ΔLRR无变化；Nig剂量依赖提升胞质与寡聚区信号，并出现高比puncta。Lico B与MCC950降低NEKfla比，ΔLRR不变。HEK293A不表达FPR1时fMLP/WKYMVm/AC2-26无响应，共表达FPR1则FRET比升约10%；U87MG中FPR1敲除削弱激动剂响应，说明NEKfla可跨上游通路报告近端NLRP3信号。

Early detection of NEK7–NLRP3 interaction prior to caspase-1 activation using NEKfla：与单多肽FPX caspase-1报告器比较，Nig处理后NEKfla的FRET/ECFP比在20分钟内显著上升，而FPX红/绿比约20分钟后才迟发上升，50分钟时NEKfla约1.10倍、FPX约1.13倍，证明NEKfla检测早于caspase-1激活的近端事件。

NEKfla enables investigation of inflammasome-associated signaling in immune cells：在Raw 264.7巨噬细胞样细胞中，LPS使比升约1.19倍、Nig约1.09倍，ΔLRR无响应；Nig提升胞质与寡聚ROI信号，Lico B与MCC950抑制NEKfla信号，表明该传感器可在免疫细胞中报告刺激依赖与抑制敏感的早期炎症小体信号。

讨论部分总结：研究人员指出NLRP3炎症小体是广泛疾病的核心平台，而NEK7–NLRP3结合是经典通路早期特有步骤。NEKfla可区分启动相关翻译后许可事件与激活态，LPS中等升高符合启动、Nig强响应符合激活。但NEKfla为全长NEK7/NLRP3工程化报告器，过表达可能造成类启动背景，因此应视为NEK7–NLRP3关联信号状态报告器而非内源复合体一一替代；puncta与NLRP3寡聚相关，但还需RACK1等因子完成生产性寡聚。该工具在HepG2、FPR1模型及Raw 264.7中均有效，虽Raw 264.7不最优解析ASC依赖事件，但胞质FRET升高或关联巨噬细胞活化状态。转化上，NEKfla可用于阿尔茨海默病淀粉样β、SARS-CoV-2细胞因子风暴等NLRP3相关炎症的早期调节物评价与上游PTM机制研究。

结论部分翻译：综上，研究人员开发了NEKfla，一种基于FRET的生物传感器，可实现早期NEK7–NLRP3相关炎症小体信号的活细胞监测。NEKfla对经典NLRP3刺激产生响应，区分ΔLRR对照的相互作用依赖反应，并比caspase-1报告器更早检测信号变化。该生物传感器在巨噬细胞样细胞与FPR1相关刺激模型中均发挥作用。这些发现确立NEKfla作为研究NLRP3炎症小体激活近端事件的有用活细胞平台。经内源与应用相关体系进一步验证后，NEKfla可支持机制研究及筛选调控早期炎症小体相关信号的化合物。