综述：基于支架、水凝胶和3D打印技术的血管化肠道类器官构建及其在药物递送中的应用

《International Journal of Nanomedicine》：Construction of Vascularized Intestinal Organoids Based on Scaffolds, Hydrogels, and 3D Printing Technologies and Their Applications in Drug Delivery

　　

肠道类器官能够再现天然肠上皮在体外的关键特征，包括其三维结构、细胞多样性和某些生理功能。因此，它们已成为研究肠道发育、疾病机制和药物发现的有价值工具。然而，传统的肠道类器官主要通过自组织产生，通常存在结构可控性有限、缺乏功能性血管网络、免疫微环境不完整以及长期培养稳定性受限等不足。这些局限性阻碍了它们忠实再现体内观察到的营养运输、炎症调控和药物吸收等复杂过程。近期在生物材料、水凝胶系统、功能性纳米材料、三维（3D）生物打印和微流控技术方面的进展，为开发血管化、具备免疫能力的工程化肠道类器官开辟了新机遇。通过定制水凝胶的力学性能、孔隙结构、降解特性和生物活性修饰，研究人员可以为肠上皮细胞、内皮细胞和免疫细胞创造一个更接近生理状态的三维微环境。此外，整合免疫细胞和微生物群相关组分，为在更贴近生理状态的微环境中研究上皮-免疫相互作用、炎症调控以及宿主-微生物群交叉对话提供了机会。结合3D生物打印技术，可以高精度地制造仿生的隐窝-绒毛结构、血管通道和空间控制的信号梯度。进一步地，整合可灌注的血管网络和微流控平台改善了氧气和营养物质的输送，从而增强了对药物摄取、跨上皮转运和免疫细胞归巢过程的模拟。本综述总结了肠道类器官基础构建、血管化策略、免疫微环境调控、支架和水凝胶材料、纳米材料和稀土基纳米材料的增强机制、3D生物打印方法以及在药物递送应用中的最新进展。同时讨论了当前的挑战和未来展望。血管化肠道类器官有望成为一个连接组织工程、疾病建模、药物递送研究和精准医学的有前景的体外平台。

引言

肠道不仅是营养消化、吸收和转运的主要器官，也是免疫调节、屏障保护和宿主-微生物群相互作用的关键界面。肠上皮细胞、免疫细胞、血管内皮细胞、基质细胞和肠道微生物群共同建立了一个高度动态的微环境，对维持肠道稳态至关重要。多种肠道疾病的发病和进展与上皮屏障功能障碍、免疫应答失调、血管异常和微环境重塑密切相关。因此，开发能忠实再现人肠道结构和功能特征的体外模型对于阐明疾病机制、评估疗效和推进个性化医疗具有重要意义。传统的二维（2D）细胞培养系统相对简单且重现性好，但无法捕捉天然肠道组织的三维结构、细胞异质性和复杂的细胞间相互作用。动物模型能提供系统性生理信息，但物种差异、实验周期长、成本高和伦理问题限制了其向人类生物学的转化。在此背景下，肠道类器官作为一种有前途的三维体外模型应运而生。尽管有这些优势，当前的肠道类器官系统仍表现出一些重要局限性。大多数传统类器官缺乏功能性血管网络，主要依赖被动扩散进行氧气和营养供应及代谢废物清除。这常导致成熟度不足、长期稳定性降低以及较大类器官内形成坏死区域。此外，许多类器官模型未纳入天然微环境的关键组分，如免疫细胞、内皮细胞和基质细胞，使得难以再现上皮、血管、免疫和细胞外基质区室之间的动态相互作用。此外，由于类器官的形成很大程度上依赖于自发的自组织，形态和空间组织经常发生变化，限制了标准化、重现性和高通量应用的可扩展性。血管化对于用于药物递送研究的肠道类器官模型尤为重要，因为口服化合物必须首先穿过肠上皮屏障，随后进入血管区室。为解决这些挑战，组织工程材料和生物制造技术越来越多地被整合到肠道类器官研究中。支架材料和水凝胶系统可以被设计成具有可调的力学性能、孔隙结构、降解谱和生物活性信号，从而提供一个可控的三维环境来支持细胞粘附、迁移、增殖和分化。功能化的水凝胶还可以作为生长因子、抗炎剂、免疫调节分子和纳米治疗剂的储存库，实现局部和持续递送，同时促进对类器官微环境的精确调控。与此同时，三维（3D）生物打印技术允许根据预定设计对细胞、生物墨水和信号分子进行空间受控沉积，使得制造仿生的隐窝-绒毛结构、血管通道和生化梯度成为可能。在众多类器官增强策略中，血管化已成为提高生理相关性的关键方法。通过内皮细胞共培养、生长因子介导的血管生成诱导、微流控灌注、牺牲模板制造和同轴生物打印技术，可以在类器官系统内建立具有管腔样结构和屏障功能的血管网络。结合微流控技术，这些系统可以进一步再现受控的剪切应力、浓度梯度和动态灌注环境，从而扩展其在药物递送研究、炎症建模和精准治疗筛选中的应用。此外，纳米颗粒和稀土基纳米材料的整合为增强血管化肠道类器官的功能提供了新的机会。稀土纳米材料以其独特的荧光发射、上转换发光、磁响应性和酶模拟活性为特征，在类器官成像、氧化应激调控、血管化增强和智能药物递送方面显示出巨大潜力。

肠道类器官的基础知识与当前应用

肠道类器官的来源与培养体系：肠道类器官是通过干细胞自组织生成的三维细胞结构，能够在体外再现肠上皮的关键结构和功能特征。根据细胞来源，可分为成人肠道干细胞（aISC）衍生类器官、诱导多能干细胞（iPSC）衍生类器官、患者衍生类器官（PDOs）和动物衍生类器官。aISC衍生类器官源自位于肠隐窝底部的Lgr5⁺干细胞，在合适的三维基质中培养时可大量增殖并保留原生组织的许多上皮特征。iPSC衍生类器官保留患者特异性遗传信息，可通过暴露于Wnt3a、R-spondin1和Noggin等发育信号因子被引导形成隐窝-绒毛样结构。患者衍生类器官保留了原始组织的突变图谱、分子特征和治疗反应谱，是研究疾病机制和评估个体化治疗策略的强大平台。成功建立肠道类器官高度依赖于三维细胞外基质，包括Matrigel、胶原蛋白、纤维蛋白和合成水凝胶系统。培养基中添加Wnt3a、R-spondin1、表皮生长因子（EGF）和Noggin等因子常用于维持干细胞自我更新和调控谱系特异性分化。最近，微流控平台和器官芯片技术的整合进一步推动了类器官培养系统的发展。

肠道类器官的结构与功能特征：在三维培养条件下，肠道类器官具有内在的自组织能力，能够重建类似于天然肠道的隐窝-绒毛样结构。它们通常发育成围绕中央管腔的空心上皮结构，包含多种特化的肠细胞群体，如肠上皮细胞、杯状细胞、潘氏细胞、肠内分泌细胞和簇细胞。从功能角度看，肠道类器官表现出基本的吸收和分泌活性，能够产生粘液、抗菌肽和各种激素，从而再现天然肠上皮的几个关键生理功能。此外，类器官保留了肠道干细胞的固有特性，包括自我更新和谱系特异性分化。Lgr5⁺干细胞在维持长期类器官生长和培养过程中的组织稳态中发挥核心作用。通过跨上皮电阻（TEER）测量、通透性测定和药物吸收研究，可以进一步评估肠道类器官的生理相关性。

肠道类器官在疾病建模、药物筛选和再生医学中的应用：肠道类器官已成为疾病建模、治疗评估和再生医学研究的多功能平台。在疾病建模领域，它们可以再现与肠道疾病相关的关键病理特征。患者衍生类器官保留了原始组织的遗传背景和分子特征，使其成为个体化疾病研究和预测治疗反应的宝贵工具。在药物发现和评估方面，肠道类器官可用于检查口服药物、小分子治疗剂和纳米药物的吸收、代谢和转运。当与血管化或免疫增强的工程系统整合时，类器官能更好地再现体内的药物递送过程和局部免疫反应，从而为评估药效提供更生理相关的平台。

肠道类器官的血管化策略

血管化对类器官成熟和药物转运的意义：血管化是工程化肠道类器官的关键步骤，对其成熟和功能发展起着根本作用。在常规体外培养系统中，类器官通常作为无整合血管网络的三维球状结构存在，氧气、营养物质和代谢废物的扩散严重受限。此外，缺乏血管区室限制了对药物递送和转运的精确建模。越来越多的证据表明，血管化类器官系统可以通过改善组织内的氧气和营养梯度来缓解扩散相关的限制。

通过内皮细胞共培养诱导血管化：与内皮细胞共培养是实现类器官系统血管化最广泛采用的方法之一。通过将血管内皮细胞（ECs）与肠上皮类器官共培养，内皮细胞可被刺激迁移、自组织并在周围基质中形成管腔样血管网络。为进一步增强血管形成和稳定性，常加入成纤维细胞或间充质细胞作为支持细胞群。

生长因子和基质信号的血管生成调控：血管网络的形成不仅依赖于内皮细胞的自组织，还取决于血管生成生长因子和细胞外基质特性的协调调控。关键的促血管生成因子包括血管内皮生长因子（VEGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、血管生成素-1（Ang-1）、血小板衍生生长因子（PDGF）和肝细胞生长因子（HGF）。此外，水凝胶和支架材料的物理和生物学特性，如机械刚度、孔隙结构、生物活性功能化和降解行为，对血管发育有显著影响。

通过微流控灌注和器官芯片技术实现血管化：微流控平台和器官芯片系统提供动态灌注环境，能够产生生理相关的剪切应力和营养梯度，从而显著增强肠道类器官的血管化。通过整合微工程通道，器官芯片设备可以建立可灌注的血管结构，支持功能性内皮管腔的形成，同时保持血管区室和肠上皮之间的空间组织。连续流体流动的存在不仅促进了血管成熟和结构稳定性，也提高了药物转运研究的生理准确性。

肠道类器官中的免疫微环境调控

免疫细胞整合与共培养策略：建立免疫学相关的微环境是开发具有生理代表性的肠道类器官模型的关键一步。一个主要目标是重建体内肠道黏膜中上皮细胞、免疫细胞和基质成分之间的动态相互作用。巨噬细胞作为关键效应细胞在类器官系统中扮演核心角色。经典活化的巨噬细胞（M1巨噬细胞）通常由脂多糖（LPS）或干扰素-γ（IFN-γ）诱导，通过激活NF-κB和STAT1信号通路放大炎症反应。替代性活化的巨噬细胞（M2巨噬细胞）在白细胞介素-4（IL-4）和白细胞介素-13（IL-13）刺激下产生，参与抗炎调控和组织修复。M2巨噬细胞可进一步分为M2a、M2b和M2c等功能亚型。

免疫微环境调控机制：肠道类器官内的免疫调控涉及一个高度协调的信号网络，其中细胞因子介导的通讯、模式识别受体（PRR）信号和代谢调控回路共同维持免疫稳态和组织功能。上皮细胞和免疫细胞之间的双向串扰是肠道免疫平衡的基本机制。模式识别受体包括Toll样受体（TLRs）和NOD样受体（NLRs），是肠道免疫监视的第一道防线。此外，代谢因素对肠道微环境中的免疫调控产生重大影响，例如短链脂肪酸（SCFAs）可通过GPR41和GPR43信号促进调节性T细胞（Tregs）的分化。

微流控芯片与肠道微环境的动态模拟：微流控芯片技术能够通过整合精确调控的流体动力学条件，实现对肠道微环境的时空可控重建。在动态培养条件下，流体诱导的剪切应力可影响上皮细胞极化和紧密连接蛋白的表达。同时，流体驱动的质量传输有助于建立细胞因子和趋化因子的稳定梯度，引导免疫细胞的定向迁移。这些动态平台还能再现间歇性或脉冲式的炎症刺激。

在炎症性疾病建模中的应用：整合肠道类器官与免疫细胞的共培养系统为建立各种炎症相关疾病模型提供了强大平台，在炎症性肠病（IBD）研究中具有特别重要的应用。这些模型能够研究遗传易感因素如何与环境影响相互作用。在治疗评估方面，类器官炎症模型可用于系统评估抗TNF-α抗体、JAK抑制剂和益生菌制剂调节炎症反应的效果。

肠道微生物群与免疫系统的相互作用：肠道微生物群与宿主免疫系统之间的相互作用构成了肠道微环境中免疫调控的基本组成部分。在类器官芯片平台上，引入共生微生物、机会致病菌或其代谢产物，可以系统研究微生物群落、肠上皮和免疫细胞之间的复杂相互作用。微生物衍生的病原体相关分子模式（PAMPs）可激活TLR和NLR信号通路，进而调控炎症介质和干扰素的表达。微生物代谢产物如SCFAs和色氨酸衍生化合物通过芳烃受体（AhR）和G蛋白偶联受体（GPCR）介导的信号通路影响免疫细胞分化和上皮屏障功能。

支架与水凝胶材料在肠道类器官中的应用

支架材料在类器官微环境中的调控作用：支架材料不仅作为肠道类器官培养的结构支撑，还通过其力学性能、结构特征和生化信号积极调控细胞行为。支架的刚度、弹性模量和孔径等参数可直接影响肠道干细胞的自我更新、谱系分化和隐窝-绒毛样上皮结构的形成。通过精确调控这些理化特性，支架系统可以创造出更接近天然肠道组织的微环境条件。

水凝胶材料在肠道类器官中的应用：水凝胶作为肠道类器官构建的主要三维培养基质，不仅提供结构支撑，还通过其力学性能、孔隙结构和生化特性提供调控细胞行为的信号。天然水凝胶包括Matrigel、胶原蛋白、纤维蛋白、明胶、透明质酸和海藻酸盐。合成水凝胶如聚乙二醇（PEG）基水凝胶、甲基丙烯酰化明胶（GelMA）、自组装肽水凝胶和可生物降解聚合物水凝胶，具有明确的组成和高度可调的特性。复合和功能化水凝胶结合了天然和合成材料的优点。

功能化与智能水凝胶的最新进展：近年来，用于肠道类器官工程和药物递送的水凝胶材料逐渐从传统的天然和合成基质，向具有智能响应性、多功能性和多模态集成特点的更复杂系统演进。刺激响应性水凝胶、基于分子识别的动态交联水凝胶和复合多功能水凝胶是其中的代表性类别。

纳米颗粒在肠道类器官工程中的应用与创新策略：纳米颗粒（NPs）已成为构建和功能调控肠道类器官的有前景的工具。在结构工程方面，纳米颗粒可作为功能性增强组分掺入水凝胶和支架材料中。在血管化方面，纳米颗粒可作为血管生成因子的递送载体，实现持续和梯度控制释放。纳米颗粒还在免疫微环境调控中发挥重要作用。在药物递送领域，整合到血管化肠道类器官平台中的纳米颗粒为研究药物吸收、转运和分布的完整序列提供了机会。

稀土纳米材料在血管化肠道类器官中的应用与新兴机制：稀土纳米材料（RENMs）因其独特的光学、磁性和催化性质而受到关注。在结构增强和成像方面，掺杂Eu³⁺、Gd³⁺、Yb³⁺和Er³⁺等离子的稀土纳米材料展现出优异的荧光和上转换发光特性。RENMs在调控类器官微环境方面也发挥着重要作用，例如二氧化铈（CeO₂）纳米颗粒具有可逆的Ce³⁺/Ce⁴⁺氧化还原循环能力和酶模拟（纳米酶）活性。在血管化方面，稀土纳米颗粒可作为血管生成因子的载体或信号放大组件。RENMs在药物递送和精准治疗中也提供了重要机遇。

3D打印技术在血管化肠道类器官构建中的应用

3D生物打印的基本原理：3D生物打印是一种利用计算机辅助设计（CAD）精确定位活细胞、生物材料和功能分子的生物制造技术。主要的生物打印方法包括挤出式生物打印、喷墨式生物打印、立体光刻（SLA）和数字光处理（DLP）、同轴生物打印和体积生物打印。

生物墨水设计：生物墨水是3D生物打印类器官构建的核心组成部分，通常由活细胞、水凝胶基质、交联系统和多种生物活性分子组成。对于血管化肠道类器官的构建，生物墨水设计需满足细胞支持性、适当的力学特性、足够的交联能力、充分的生物功能和最佳的可打印性等关键要求。

血管通道与肠道结构的3D生物打印：功能性血管网络的建立被认为是肠道类器官成熟和生理功能的先决条件。当前血管通道的制造主要采用同轴生物打印和牺牲模板策略相结合的方法。3D生物打印还能精确重建肠道隐窝-绒毛结构。最重要的是，血管通道与工程化肠道结构的整合赋予了类器官系统灌注能力和动态质量传输功能。

3D打印类器官模型的优势与挑战：3D打印类器官模型的主要优势在于其精确工程化生物微环境和再现复杂生理功能的能力。然而，打印过程中细胞活力和生物活性可能受到不利影响，打印分辨率与构建物尺寸之间存在根本性的权衡关系，同时再现功能性脉管系统、免疫组分和成熟的肠道上皮特征在技术上仍然具有挑战性。

血管化肠道类器官在药物递送中的应用

口服药物吸收与转运评价：血管化肠道类器官为研究口服药物的吸收和转运提供了一个先进的体外平台。通过整合微流控技术或3D生物打印的可灌注血管网络，这些系统能更准确地再现化合物穿过肠上皮并进入血管区室的整个过程。

纳米药物递送系统评价：血管化肠道类器官也是评估纳米药物递送系统靶向性能和穿透能力的宝贵平台。在炎症条件下，可以详细评估纳米载体的稳定性、内皮摄取、跨上皮转运效率和免疫细胞反应等额外参数。

基于水凝胶的缓释药物递送平台：当与功能化水凝胶系统结合时，血管化肠道类器官可作为研究局部缓释药物递送的平台。水凝胶可负载抗炎剂、免疫调节分子或小分子治疗剂，实现控制药物释放，同时维持目标部位的治疗浓度。

患者源性类器官用于个性化药物筛选：患者源性肠道类器官（PDOs），特别是与血管化和免疫系统整合策略相结合时，为个性化药物筛选提供了一种有前景的方法。在患者特异性类器官模型中进行的药物吸收、转运和免疫反应检测，有助于预测个体对常规药物和纳米药物递送系统的治疗反应差异。

药物毒性与治疗效果评估：血管化肠道类器官模型为同时评估药效和毒性提供了一个综合平台。通过监测上皮功能、血管通透性、炎症介质产生和免疫细胞活性等参数，研究人员可以定量评估治疗药物对肠上皮组织和血管网络的影响。

当前挑战与未来展望

血管成熟度和功能性不足：尽管内皮细胞共培养和生长因子介导的策略已在类器官系统内形成了初步的血管样网络，但大多数血管化类器官仍未实现完全功能性灌注。未来的工作应侧重于优化血管化策略。

材料标准化与重现性挑战：常用于类器官培养的天然水凝胶批次间变异大，而合成和复合水凝胶在支持多细胞共培养系统和促进高效血管化方面仍有局限。开发下一代水凝胶系统对于提高重现性和促进转化应用至关重要。

平衡打印分辨率、细胞活力与结构复杂性：实现高打印分辨率通常需要对细胞施加更大的机械或光化学压力，可能降低细胞活力。未来的研究应侧重于优化打印参数、改进生物墨水配方和开发更有利于细胞的交联策略。

复杂多细胞肠道微环境的重建：天然肠道微环境由上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞、免疫细胞、神经组分和微生物群落之间的复杂相互作用构成。未来发展应整合多细胞共培养方法与血管化、免疫系统整合和动态微流控技术。

迈向精准医学和临床转化的未来方向：血管化和免疫增强的肠道类器官在个性化药物筛选、精准治疗和再生医学方面具有巨大潜力。