《Microorganisms》：Enumeration Method for Pseudomonas aeruginosa in Water with High Bacterial Background Flora
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可靠地检测水中的铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa, PA）对于公共卫生水质评估至关重要，然而基于培养的方法仍面临高背景菌群的挑战。本研究比较了mPA-C琼脂和商业化的RAPID’ P. aeruginosa（RAPID PA）琼脂在（
可靠地检测水中的铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa, PA）对于公共卫生水质评估至关重要，然而基于培养的方法仍面临高背景菌群的挑战。本研究比较了mPA-C琼脂和商业化的RAPID’ P. aeruginosa（RAPID PA）琼脂在（臭氧）处理废水出水及（加标）游泳池塘水中的性能，并评估了假定菌落颜色定义和确认步骤对性能特征的影响。mPA-C表现出强烈的基质依赖性和较高的观察者间变异性，原因是（PA和非PA）菌落颜色变异范围广。RAPID PA则产生更清晰且更一致的色素沉着，背景生长相对有限，并且在不同基质中表现更稳定。扩大假定菌落颜色定义显著提高了RAPID PA的灵敏度，且特异性损失极小。在RAPID PA上进行快速传代培养以进行目视确认，进一步提高了特异性，并显著降低了假阳性率。延长培养至48 h仅对游泳池塘水提升了性能。RAPID PA在不同基质中的表现更为一致。总体而言，使用RAPID PA并配合扩展的颜色标准和传代培养这一低工作量确认步骤，可在高背景菌群水样中实现有效的基于培养的铜绿假单胞菌检测。该培养基可作为常规监测中实用且稳健的替代方案。
铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa, PA）是一种革兰氏阴性机会致病菌，广泛分布于地表水、游泳池塘、饮用水系统和废水处理设施中。其可耐受臭氧处理并在储存中再生长，且对多种抗生素具有耐药性。因此，准确检测水中PA对公共卫生水质评估至关重要。然而，目前欧洲洗浴水法规仅将大肠埃希菌和肠球菌列为强制指标，未包括PA。现有参考方法中，基于膜过滤和CN琼脂的菌落计数法适用于低背景水，MPN法虽可处理高背景样品但无法获得菌落；旧荷兰标准中的mPA-D琼脂已失效，修改版mPA-C琼脂在澳新标准中使用，但缺乏国际参考方法，且mPA-C菌落颜色多样，需要高度经验和确认步骤。本研究正是为了满足游泳池塘等高背景菌群水体的PA计数需求而开展。
研究人员开展了一项系统的培养基性能评价研究，于2023年5月至2024年2月在荷兰采集样本，包括来自两座污水处理厂（分别服务106,285和48,685居民）的二级处理出水和臭氧处理出水，以及游泳池塘水（大多数进行了加标，加标物为污水处理厂进水或六株形态不同的PA）。通过膜过滤过滤不同体积水样，将滤膜分别置于mPA-C和RAPID PA琼脂上，在41.5±1°C培养21±3小时。记录所有菌落颜色，并将菌落在相应琼脂上纯化，使用MALDI-TOF MS鉴定。根据ISO 13843:2017计算灵敏度、特异性、假阳性率、假阴性率、选择性和效率。研究还评估了扩大假定菌落颜色定义（如加入灰色、粉色、棕色）以及传代培养和延长培养（44±4小时）对性能的影响。结果表明，RAPID PA琼脂比mPA-C琼脂具有更稳定的色素沉着、更少的背景干扰和更高的跨基质一致性；扩大定义加入棕色菌落显著提高了RAPID PA的灵敏度，传代培养则显著提高了特异性并降低假阳性；延长培养仅对游泳池塘水有益。总体而言，RAPID PA结合适当颜色定义和传代培养是高背景菌群水中PA检测的实用稳健方法，为常规监测提供了一种有效替代。该研究发表在《Microorganisms》杂志。
主要关键技术方法包括：膜过滤培养法，使用0.45 μm微孔滤膜过滤水样，分别培养于mPA-C琼脂和RAPID PA琼脂；菌落颜色分类法，根据文献和制造商描述定义假定菌落颜色，并利用热图分析菌落颜色与菌种关系；基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）鉴定，用于确认分离菌种；性能特征计算方法，按ISO 13843:2017计算灵敏度、特异性等指标；方法优化策略，包括扩大假定颜色定义、传代培养和延长培养。样本来源为荷兰两座污水处理厂及游泳池塘，共20个水样。
结果如下。
**3.1 mPA-C和RAPID PA琼脂上铜绿假单胞菌和背景菌群的菌落颜色特征**：通过热图直观展示菌落颜色与属分类的分布。结果显示，mPA-C琼脂上PA菌落颜色谱宽且基质依赖性强，除棕色外还出现粉色、黄色、橙色、灰色等，非PA菌也产生类似颜色；RAPID PA琼脂上PA菌落主要呈蓝/绿色和棕色，非目标菌落较少且颜色不典型，表明RAPID PA的颜色可解释性更高。
**3.2 24小时培养后mPA-C和RAPID PA琼脂上各种假定菌落的细菌组成**：基于MALDI-TOF MS鉴定，研究人员比较了不同颜色定义下假定菌落中PA的比例。对于mPA-C，将灰色纳入假定色基本不改变检出，加入粉色后PA数量增加但确认率下降；对于RAPID PA，将棕色纳入假定色使废水样品中确认的PA数量从12增至151，游泳池水中从92增至205，且确认率上升。此外，观察者间颜色判读一致性在RAPID PA上（kappa=0.44）高于mPA-C（kappa=0.11）。
**3.3 RAPID PA琼脂上传代培养和延长培养后扩展假定菌落的细菌组成**：在扩展颜色定义基础上，对假定菌落进行传代培养可淘汰不能在RAPID PA上继续生长的非PA菌。废水中传代培养后确认率从66.7%升至87.2%，PA数量基本不变；游泳池水中从83.7%升至98.1%。延长培养使废水中确认率略降至64.0%，游泳池水中PA数量增加且确认率升至96.3%。这提示传代培养更适合高背景基质，延长培养在低背景基质中可能更优。
**3.4 mPA-C和RAPID PA琼脂的性能特征**：按照ISO 13843:2017计算，mPA-C在标准颜色定义下灵敏度较低，扩展至灰色和粉色后灵敏度显著提高，但特异性和效率下降，假阳性率上升。RAPID PA在扩展颜色定义（加入棕色）后灵敏度显著提高，且特异性损失小；传代培养进一步显著提高特异性并降低假阳性率；延长培养仅对游泳池水显著提高灵敏度并降低假阴性率。总体性能RAPID PA优于mPA-C。
讨论总结：研究人员讨论了颜色定义、确认步骤和基质差异的影响。颜色判定是影响性能的关键因素，mPA-C的颜色谱过于宽泛且依赖观察者；RAPID PA颜色稳定因此更易判读。传代培养能明显减少假阳性，因为部分非PA菌可在滤膜上形成假定菌落但
