PPM1L依赖的PD-L1去磷酸化调控肿瘤类型特异性的泛素连接酶识别，从而决定PD-L1的降解过程

《Cell Reports》：PPM1L-dependent PD-L1 dephosphorylation orchestrates tumor-type-specific ubiquitin ligase recognition to govern its degradation

　　亮点：
- PD-L1的磷酸化决定了在异质性肿瘤细胞中的选择性E3识别
- PPM1L协调PD-L1的磷酸化，以决定E3的选择性招募
- SERPINB1解除ARIH1的自抑制，形成额外的PD-L1调节层
- PPM1L-SERPINB1-PD-L1轴是一个有前途的组合治疗靶点

摘要：
作为癌症治疗的强大临床策略，针对PD-1/PD-L1轴的免疫检查点阻断经常受到多种抵抗机制的阻碍。深入阐明控制PD-L1稳态的分子机制对于提高免疫治疗反应率至关重要。在这里，我们证明了PPM1L-E3s-SERPINB1级联在调节PD-L1稳定性方面起着关键作用。具体来说，PPM1L调节的PD-L1磷酸化状态决定了其被不同的E3泛素连接蛋白（包括ARIH1、RING1和RNF2）识别，从而以癌症类型依赖的方式促进其蛋白酶体降解。此外，我们发现SERPINB1是PD-L1泛素化和降解的驱动因素，其功能是特异性地解除ARIH1的自抑制。此外，在小鼠模型中，PPM1l的缺乏与抗PD-1免疫治疗显示出协同的抗肿瘤效果。值得注意的是，PPM1L和SERPINB1的表达水平在临床上具有重要意义。总的来说，我们的发现描绘了控制PD-L1稳态的调节景观，并强调了精准治疗策略的重要性。

图形摘要

引言：
抗PD-1/PD-1免疫检查点疗法的广泛耐药性的出现严重限制了其临床效果。PD-L1的活性受到包括基因异常、转录调控和翻译后修饰（PTMs）在内的分层网络的严格调控。其中，磷酸化作为关键调节因子，协调PD-L1的动态及其与其他PTMs的相互作用。深入阐明PD-L1的磷酸化对于识别治疗靶点以提高免疫治疗效果至关重要。

PD-L1的磷酸化在其稳定性调控中起着关键作用。例如，糖原合成酶激酶3α（GSK3α）介导的PD-L1磷酸化增强了其与ARIH1的相互作用，而GSK3β介导的磷酸化诱导了β-TrCP介导的泛素化，这两者都促进了蛋白酶体降解。相反，酪蛋白激酶2（CK2）介导的磷酸化破坏了PD-L1与E3连接蛋白适配器SPOP的结合，而Janus激酶1（JAK1）对酪氨酸112（Y112）的磷酸化增强了PD-L1的糖基化和稳定性。这些发现突出了磷酸化对PD-L1周转的情境依赖性和多方面的影响。控制PD-L1的磷酸化已成为肿瘤治疗的一个有前途的目标。例如，ES-072、二甲双胍和D-甘露糖已被证明可以促进PD-L1的磷酸化和随后的降解。相反，CK2抑制剂通过阻断磷酸化并诱导树突状细胞分泌CD80来促进PD-L1降解，从而重新激活T细胞的抗肿瘤活性。值得注意的是，将这些药物与免疫检查点阻断或放射治疗结合使用可以显著抑制肿瘤生长并延长带瘤小鼠的生存期，突显了它们在联合治疗中的潜力。重要的是，动态的磷酸化状态由激酶和磷酸酶的相反作用共同调控。去磷酸化在微调磷酸化平衡和精确调控PD-L1方面起着不可或缺的作用。然而，控制PD-L1去磷酸化的分子机制仍然大部分不清楚。在这里，我们证明了PPM1L介导PD-L1的去磷酸化，以控制其被多种E3泛素连接蛋白（例如ARIH1、RING1和RNF2）识别以及随后的蛋白酶体降解。进一步分析表明，SERPINB1（丝氨酸蛋白酶抑制剂B1）通过解除ARIH1的自抑制在PD-L1稳定中起关键作用。

SERPINB1主要因其调节炎症和中性粒细胞存活的作用而受到关注。越来越多的证据将SERPINB1与多种病理过程联系起来，如感染、炎症损伤和肿瘤迁移。值得注意的是，在胶质瘤患者中，高水平的SERPINB1与良好的预后密切相关。此外，在卵巢癌队列中，发现SERPINB1与免疫细胞亚群的浸润呈正相关。尽管有这么初步的发现，SERPINB1在调节肿瘤免疫中的功能和潜在机制仍不清楚。总的来说，我们的发现揭示了一个涉及PPM1L、SERPINB1和E3s的PD-L1调节级联。这项研究扩展了我们对控制PD-L1动态的复杂调节网络的理解，并强调了精准治疗的重要性。

结果：
- PPM1L在活细胞中积极调节PD-L1的稳定性，以减轻T细胞的毒性
为了识别PD-L1的潜在翻译后调节因子，我们使用了基于邻近性的标记系统PUP-IT（基于Pupylation的交互作用标记），该系统通过连接酶PafA将生物素化的Pup(E)共价连接到附近的蛋白质上（图S1A）。随后的链霉亲和素纯化和质谱分析（图S1A）发现，在表达PD-L1-Flag-PafA的样本中，磷酸酶PPM1L的赖氨酸57被Pup(E)修饰（图S1B）。一致地，PPM1L中的Lys57的细胞质位置与PD-L1-PafA中的PafA的细胞质位置对齐（图S1C）。为了验证这一点，我们在HEK 293T细胞中共表达了PD-L1-Flag-PafA、Pup(E)和HA-PPM1L。使用抗-HA抗体进行免疫印迹检测到一个额外的条带，表明PPM1L被Pup(E)修饰（图1A）。此外，共免疫沉淀（Co-IP）证实了PPM1L与PD-L1在HEK 293T细胞和HCT 116结直肠癌细胞中的相互作用（图1B和S1D）。总之，这些发现表明PPM1L是PD-L1的潜在相互作用伴侣。

图1 PPM1L积极调节PD-L1的稳定性并减轻T细胞介导的细胞毒性
- PUP-IT系统用于识别PD-L1和PPM11之间的相互作用。共表达PD-L1-Flag-PafA或Flag-PafA与HA-PPM1L和Bio-Pup(E)的细胞被收集起来，使用抗Flag和抗HA抗体进行免疫印迹。
- 共免疫沉淀分析验证了HCT 116细胞中PD-L1和PPM11之间的相互作用。
- PPM1L的敲低导致RKO细胞中的PD-L1蛋白水平下降。
- GAPDH被用作加载对照。
- PPM1L的重新表达在PPM1L缺乏的RKO细胞中恢复了PD-L1蛋白水平。
- 在PPM1L KD RKO细胞中，膜定位的PD-L1显著减少。
- 免疫印迹结果显示，Na+/K+-ATPase被用作加载对照。
- PPM1L缺乏减少了RKO细胞的PD-1结合能力。
- PPM1L的过表达增强了T细胞对RKO细胞的细胞毒性。活化的T细胞与RKO shCTRL或shPPM1L细胞共培养。使用caspase-3/7活细胞检测探针评估T细胞诱导的肿瘤细胞凋亡。

为了评估PPM1L对PD-L1的影响，我们在多种人类癌细胞中进行了PPM1L的敲低（KD），如结肠癌RKO细胞、黑色素瘤A375细胞和三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞。正如预期的那样，在PPM1L KD细胞中成功地实现了PPM1L转录的强烈和显著下调（图S1E）。值得注意的是，PPM1L的耗竭并未引起PD-L1转录水平的统计学上显著的改变（图S1F），这表明PPM1L在翻译后水平上调节PD-L1表达。免疫印迹分析表明，PPM1L的缺乏（图1C、S1G和S1H）减少了RKO（图1C和1D）、MDA-MB-231（图1I和S1J）和A375细胞（图1K）中的PD-L1蛋白含量。这些结果表明，PPM1L可能在多种癌症背景下作为PD-L1的广泛正向调节因子。相反，在PPM1L缺乏的RKO细胞中恢复PPM1L表达恢复了PD-L1表达（图1E和1F）。一致地，PPM1L的过表达增强了RKO细胞中的PD-L1水平（图S1L）。流式细胞术（图1G）、免疫印迹（图1H、S1M和S1N）和免疫荧光染色（图1I）显示，PPM1L KD细胞中的PD-L1在质膜上的表达水平显著降低。PPM1L的丢失并未改变RKO、A375或MDA-MB-231细胞中的MHC I类（MHC-I）蛋白水平，这强调了PPM1L在调节PD-L1方面的特定调节作用，而不是广泛影响抗原呈递机制（图1J和S1O–S1R）。总之，这些发现表明PPM1L是癌细胞中PD-L1的广泛正向调节因子。

为了研究PPM1L缺失是否影响PD-1的结合，我们将PPM1L KD RKO细胞与重组人PD-1-Fc嵌合蛋白孵育，以评估PD-1的结合活性。流式细胞术分析显示，PD-1与PPM1L KD RKO细胞表面的结合显著减少（图1K）。此外，我们将RKO细胞与来自人外周血单核细胞（PBMCs）的活化T细胞共孵育，发现PPM1L的缺乏显著增强了癌细胞对T细胞毒性的敏感性（图1L和1M）。

PPM1L介导的PD-L1去磷酸化防止其蛋白酶体降解
为了阐明PPM1L对PD-L1的调节机制，我们分别用蛋白酶体抑制剂（MG132）、内质网相关降解抑制剂（EerI）和溶酶体抑制剂氯喹（CQ）处理细胞。MG132（而不是CQ和EerI）在PPM1L缺失的情况下抑制了PD-L1的降解（图2A、2B和S2A–S2E），表明PPM1L缺失通过蛋白酶体途径促进PD-L1的降解。为了检查糖基化和非糖基化PD-L1的泛素化，我们生成了一个糖基化缺陷型PD-L1突变体（PD-L14NQ），该突变体在四个天冬酰胺位置替换为谷氨酰胺（N35Q、N192Q、N200Q和N219Q），从而完全 abolishes PD-L1的糖基化。与蛋白酶体降解模式一致，PPM1L KD细胞中糖基化和非糖基化PD-L1的泛素化水平显著增加（图2C和2D）。此外，靶向泛素链检测证实，PPM1L缺失主要促进了PD-L1和PD-L14NQ的K48-linked泛素化（图2E和S2F），这是针对蛋白进行蛋白酶体降解的典型泛素修饰。环己酰胺追踪实验显示，PPM1L KD后PD-L1的半衰期显著缩短，进一步验证了PPM1L耗竭加速了PD-L1蛋白的周转（图2F和2G）。总之，这些结果表明PPM1L在癌细胞中通过蛋白酶体途径防止PD-L1的降解。

图2 PPM1L介导的PD-L1去磷酸化防止其蛋白酶体降解
- PPM1L通过蛋白酶体途径调节PD-L1的降解。细胞用20 μM MG132处理10小时。
- PPM1L敲低增加了PD-L1的泛素化水平。表达PD-L1-StrepII的RKO shCTRL和shPPM1L细胞接受了StrepII免疫沉淀分析。
- PPM1L的敲低增强了非糖基化PD-L1（PD-L14NQ突变体）的泛素化。
- PPM1L的敲低提高了RKO细胞中PD-L1的K48-linked泛素化水平。细胞用MG132（5 μM）处理12小时后进行收获，并进行StrepII IP。
- PPM1L缺乏加速了PD-L1的降解。
- PPM1L的敲低提高了RKO细胞中PD-L1的磷酸化水平。
- PPM1L的催化活性对于维持RKO细胞中的PD-L1稳定性是必需的。
- 三个独立生物重复实验的量化结果显示，PPM1L敲低后PD-L1在S279和S283位的磷酸化增加。
- PPM1L缺乏未能调节PD-L12SA突变体的降解。
- PPM1L作为丝氨酸/苏氨酸磷酸酶，通过负调控TGF-β和BMP信号通路被确定为结肠肿瘤发生的抑制剂。我们发现，在PPM1L缺乏的细胞中PD-L1的磷酸化水平显著升高（图2H）。为了确定其对PD-L1的调节是否依赖于其催化活性，我们引入了一个缺乏磷酸酶活性的突变体PPM1LD302A。该突变不影响其与PD-L1的相互作用（图S2G），也不影响野生型（WT）和PPM1L缺乏的RKO细胞中的PD-L1表达（图2I、2J、S2H和S2I）。这些结果表明，PPM1L的磷酸酶活性对PD-L1的稳态调节至关重要。

为了识别PPM1L修饰的PD-L1残基，我们首先检查了PPM1L缺乏的RKO细胞中PD-L1磷酸化的变化。在PPM1L缺失后，PD-L1在S279/283位的磷酸化增加（图2K、S2J和S2K）。先前的研究表明，GSK3α介导的PD-L1在Ser279和Ser283位的磷酸化促进了其蛋白酶体降解。我们的结果揭示，PD-L1S279/283A和PD-L1S279/283D完全防止了PPM1L缺失诱导的PD-L1降解（图2L）。随后的环己酰胺追踪实验进一步证实，PPM1L KD对PD-L1S279/283A突变体的蛋白稳定性没有明显影响（图2M和2N）。这些数据共同强烈表明，S279和S283残基对于PPM1L介导的PD-L1翻译后调控至关重要。囊泡相关膜蛋白相关蛋白A（VAPA）之前已被鉴定为PPM1L的内质网驻留结合伙伴，它有助于去磷酸化神经酰胺转运蛋白CERT。受到这一相互作用的启发，我们进一步探讨了VAPA是否参与了PPM1L-PD-L1调控轴。共免疫沉淀（Co-IP）结果证实，PD-L1不仅与PPM1L相互作用，还与VAPA相互作用（图S2L）。值得注意的是，在PPM1L缺失后，PD-L1与VAPA的相互作用显著减弱（图S2M）。

PPM1L调控的PD-L1磷酸化状态是控制不同肿瘤中多种E3蛋白识别机制的关键。据报道，Ser279/283的磷酸化可以促进ARIH1介导的PD-L1泛素化及其降解。我们发现，PPM1L敲低（KD）显著增强了ARIH1与PD-L1的结合（图3A）。然而，PPM11缺失导致的PD-L1水平降低并不能完全通过ARIH1 KD来逆转，这表明可能有其他E3泛素连接酶参与调节PD-L1的稳定性（图S3A）。

图3 PPM1L调控的PD-L1磷酸化状态是控制多种E3蛋白识别的关键机制

图说明：
(A) PPM1L敲低显著增强了RKO细胞中PD-L1与ARIH1的相互作用。
(B) 火山图显示了PPM11缺失时PD-L1相互作用组的变化（log2FC > 0.5，p < 0.05）。
(C) 通过PPM11耗竭显著改变的PD-L1相互作用蛋白的GO富集分析（log2FC > 0.5，p < 0.05）。
(D和E) 在PPM1L敲低后的RKO细胞中，PD-L1与RING1（D）或RNF2（E）的相互作用增强。
(F和G) (F) RING1和ARIH1的同时敲低在PPM11缺陷的RKO细胞中协同恢复了内源性PD-L1表达。
(G) 来自四个独立生物学重复实验的PD-L1表达量化结果。数据以平均值±标准误表示。
(H) RING1和ARIH1在PPM11缺陷的RKO细胞中抑制内源性PD-L1的泛素化。
(I) 不同肿瘤细胞系中ARIH1、RING1和RNF2的相对蛋白质表达。归一化的相对蛋白质表达（nRPX）通过颜色强度表示；白色表示无法检测到的蛋白质。
(J和K) RING1、RNF2和ARIH1对Huh 7（J）和MDA-MB-231（K）细胞中PD-L1表达水平的影响。

为了探究可能参与PPM11介导的PD-L1调控的其他E3蛋白，我们比较了shCTRL和shPPM1L RKO细胞中PD-L1的相互作用蛋白组（图3B）。基因本体论（GO）分析显示，在PPM11耗竭后，蛋白酶体介导的催化过程显著富集（图3C），其中E3泛素连接酶如RNF2、RING1、ZNF598和COP1（RFWD2）被显著列出（图S3B）。共免疫沉淀证实，在PPM1L敲低后的RKO细胞中，PD-L1与RNF2和RING1的相互作用显著增加，而与ZNF598和COP1的相互作用则没有（图3D、3E、S3C和S3D）。此外，PD-L1S279/283A突变体与ARIH1和RING1的相互作用显著减少（图S3E和S3F），表明S279和S283残基在其相互作用中起重要作用。

RING1和RNF2是多梳抑制复合物1（PRC1）的核心催化亚基，后者作为经典的染色质相关E3泛素连接酶。为了探讨RNF2和RING1是否可以调节细胞质中的PD-L1蛋白表达，我们首先使用核-细胞质分级技术检查了它们的亚细胞定位。结果表明，RNF2和RING1主要位于细胞核中，但两种蛋白质在细胞质中也有可检测到的丰度——这种表型在相应基因被靶向敲低后减弱（图S3G）。这种亚细胞分布模式为它们可能与细胞质中的PD-L1相互作用提供了空间基础。然而，与ARIH1敲低的表型一致，单独敲低RNF2或RING1未能完全恢复PPM11缺失在RKO细胞中引起的PD-L1水平降低（图3F和3G）。这些部分恢复效果促使我们假设，多种E3泛素连接酶在RKO细胞中协同调节PPM11介导的PD-L1降解。为了验证这一假设，我们在ARIH1敲低的RKO细胞中分别敲低了RING1或RNF2（图S3H）。在PPM11缺陷的RKO细胞中，RING1的丢失与ARIH1协同作用恢复了PD-L1表达（图3F和3G）。一致地，PPM11缺失引起的PD-L1泛素化增加明显被ARIH1和RING1的删除所抑制（图3H）。总之，这些发现表明，在PPM11缺失的RKO细胞中，ARIH1和RING1作为主要的E3泛素连接酶共同负责PD-L1的泛素化及其后续降解。

有趣的是，共免疫沉淀实验显示，RING1对非糖基化PD-L1具有优先结合亲和力（图3D），而ARIH1主要与完全糖基化的PD-L1相互作用（图3A）。相比之下，RNF2对糖基化和非糖基化PD-L1形式具有相当的结合能力（图3E）。为了进一步确认ARIH1和RING1的糖基化依赖性结合选择性，我们使用了PD-L14NQ突变体进行进一步研究。随后的共免疫沉淀实验表明，RING1在RKO细胞中与非糖基化的PD-L14NQ突变体有很强的结合能力（图S3I）。此外，在PPM11缺失的情况下，RING1和PD-L1的结合能力进一步增强（图S3J）。这些数据共同表明，ARIH1优先与糖基化PD-L1相互作用，而RING1则更倾向于与非糖基化PD-L1结合。

此外，人类蛋白质图谱（HPA）数据库的数据分析显示，ARIH1、RING1和RNF2在各种肿瘤细胞系中的表达模式存在差异（图3I）。因此，我们假设多种因素的结合决定了哪种E3蛋白在不同肿瘤中调控PD-L1，包括各个E3蛋白的表达水平、底物特异性偏好、亚细胞定位特征以及不同的微环境特性。为了验证这一点，我们在不同的癌细胞中分别敲低了ARIH1、RING1或RNF2，并观察了它们对PD-L1表达的影响（图3J、3K和S3K）。值得注意的是，在RKO细胞中检测到了ARIH1，它调节了PD-L1的稳定性（图S3A和3I）。相反，在Huh-7细胞中未观察到ARIH1的表达，因此无法调节该细胞系中的PD-L1稳定性（图3I和3J）。在MDA-MB-231细胞中，RNF2的表达水平相对较高，并且与ARIH1和RING1相比对PD-L1稳定性的调节作用更为显著（图3I和3K）。调节PD-L1的E3连接酶的组成在不同癌细胞系中可能有显著差异，反映了功能冗余和特异性。

SERPINB1缓解了ARIH1的自我抑制，从而促进了PD-L1的泛素化。值得注意的是，我们发现SERPINB1（一种白细胞弹性蛋白酶抑制剂）在来自PPM11缺失样本的PD-L1蛋白组中显著富集（图3B）。共免疫沉淀实验表明，PPM11缺失显著增强了SERPINB1与PD-L1的相互作用（图4A）。此外，SERPINB1与PD-L1S279/283A之间的相互作用明显减弱（图S4A），表明它们的结合亲和力受到PD-L1 S279和S283残基磷酸化的影响。

图4 SERPINB1缓解了ARIH1的自我抑制，促进了PD-L1的泛素化

图说明：
(A) 在PPM11敲低的RKO细胞中，PD-L1与SERPINB1的相互作用显著增强。
(B和C) (B) SERPINB1敲除导致RKO细胞中PD-L1蛋白表达增加。
(C) PD-L1表达的量化结果。数据以平均值±标准误表示。
(D和E) SERPINB1通过蛋白酶体途径调节PD-L1表达。细胞用10 μM MG132处理10小时。
(F) SERPINB1对PD-L1泛素化的影响。
(G和H) (G) SERPINB1以ARIH1依赖的方式调节RKO细胞中的PD-L1稳定性。
(H) PD-L1蛋白水平的量化结果。数据以平均值±标准误表示。
(I) SERPINB1与ARIH1和PD-L1形成三元复合物。
(J) Ariadne结构域在ARIH1与SERPINB1的相互作用中起重要作用。
(K) SERPINB1以剂量依赖的方式有效消除了Ariadne结构域与ARIH1催化区域之间的相互作用。
(L和M) SERPINB1以Ariadne结构域依赖的方式促进了ARIH1介导的PD-L1降解。
(M) 来自三个独立生物学重复实验的PD-L1表达量化结果。数据以平均值±标准误表示。

为了研究SERPINB1在PD-L1调控中的作用，我们生成了SERPINB1敲除（KO）的RKO细胞（图S4B）。SERPINB1的缺失并未影响PD-L1的转录水平（图S4C）。相反，SERPINB1的丢失显著增强了PD-L1蛋白表达（图4B和4C），表明SERPINB1在翻译后水平上调节PD-L1。一致地，SERPINB1在RKO细胞中以剂量依赖的方式减少了PD-L1表达（图S4D）。随后的抑制剂处理表明，CQ而不是MG132进一步增强了SERPINB1缺失细胞中的PD-L1表达（图4D、4E、S4E和S4F），表明SERPINB1以蛋白酶体依赖的方式调节PD-L1稳定性。此外，SERPINB1的缺失导致PD-L1泛素化水平降低（图4F）。总之，这些发现表明SERPINB1促进了PD-L1的泛素-蛋白酶体降解。

先前的研究报道SERPINB1的过表达可促进IκB激酶ε（IKBKE）的蛋白酶体降解，但其具体机制尚不清楚。为了阐明SERPINB1如何调节PD-L1的蛋白酶体降解，我们分别在RING1缺失和ARIH1缺失的RKO细胞中敲除了SERPINB1（图S4G和S4H）。ARIH1的缺失未能进一步增加SERPINB1缺失细胞中的PD-L1表达（图4G和4H），表明SERPINB1-ARIH1级联反应通过相同的途径调节PD-L1。相反，RING1敲低导致SERPINB1缺失细胞中的PD-L1表达增加（图S4I和S4J），这意味着RING1介导的调控机制独立于SERPINB1。此外，共免疫沉淀实验显示SERPINB1能够同时共沉淀ARIH1和PD-L1（图4I）。综合这些结果，表明SERPINB1特异性地调节了ARIH1依赖的PD-L1降解。这种差异化的调控模式突显了PD-L1稳态的复杂性，并为开发针对这些不同途径的靶向治疗提供了潜在途径。

比较ARIH1和RING1的结构（图S4K），我们发现ARIH1中存在一个先前描述的自我抑制结构域，而RING1中不存在。具体来说，ARIH1的Ariadne结构域与其催化核心在分子内相互作用以抑制其E3活性。为了探讨SERPINB1是否通过这种结构特征调节ARIH1的功能，我们首先验证了SERPINB1与ARIH1 Ariadne结构域之间的物理相互作用（图S4L）。进一步的截短和结合实验证实，Ariadne结构域对于ARIH1与SERPINB1之间的强相互作用是必不可少的（图4J），表明SERPINB1结合到自我抑制区域以潜在地调节ARIH1的活性。功能验证实验进一步表明，Ariadne结构域的过表达以剂量依赖的方式增强了PD-L1表达（图S4M）。此外，Ariadne结构域与ARIH1的催化区域相互作用，而SERPINB1以剂量依赖的方式有效地破坏了这种分子内相互作用（图4K）。这些结果表明，SERPINB1结合在空间上竞争了Ariadne结构域与ARIH1催化核心之间的分子内结合，从而缓解了ARIH1的自我抑制。

为了验证Ariadne结构域在ARIH1介导的PD-L1降解中的功能重要性，我们在ARIH1敲低的RKO细胞和ARIH1-SERPINB1双敲低RKO细胞中分别恢复了野生型ARIH1或Ariadne结构域缺失突变体（ARIH1ΔAriadne）的表达（图S4K）。ARIH1和ARIH1ΔAriadne在ARIH1敲低的RKO细胞中有效地促进了PD-L1降解（图4L和4M）。然而，只有ARIH1ΔAriadne突变体在ARIH1-SERPINB1双缺失的RKO细胞中降低了PD-L1表达（图4L和4M），表明SERPINB1在Ariadne结构域依赖的机制中起着重要作用。ARIH1在第427位丝氨酸的磷酸化已被证明会破坏其与Ariadne结构域的分子内结合，从而缓解其自我抑制。一致地，ARIH1的磷酸模拟突变体（ARIH1S427D）在SERPINB1缺失的细胞中有效促进了PD-L1降解（图S4N）。

已知ARIH1介导了neddylated Cullin-RING泛素连接酶（CRL）复合物的泛素化，包括cyclin E的泛素化。确实，ARIH1的缺失导致PD-L1和cyclin E的表达上调。然而，SERPINB1的缺失选择性地上升了PD-L1的水平，而没有影响cyclin E的表达，表明SERPINB1以底物特异性的方式调节ARIH1的功能（图S4O）。

总之，这些发现支持SERPINB1通过缓解ARIH1的自我抑制来增强PD-L1稳定性的模型。为了验证我们在体外发现的实际生理和治疗相关性，我们探讨了PPM1L在体内的免疫检查点阻断中的作用。我们首先使用CRISPR-Cas9系统生成了Ppm1l-KO的CT26结肠癌细胞。Sanger测序确认了目标Ppm1l位点的成功移码突变（图5A）。免疫印迹显示，PPM11的缺失显著降低了CT26细胞中的PD-L1蛋白水平（图5B）。此外，在Ppm1l-KO细胞中外源性地重新表达小鼠PPM1L能够恢复PD-L1的表达（图5C），这牢固地确立了PPM1L对PD-L1表达的直接调控作用。图5 Ppm1l缺乏可在同基因小鼠模型中增强抗PD-1免疫疗法。显示完整标题 图片查看器（A）CRISPR-Cas9介导的Ppm1l基因敲除及验证。单导向RNA（sgRNA）的靶点位于外显子1内，靶序列以浅绿色突出显示。WT等位基因和两个独立的Ppm1l敲除单克隆系的核苷酸序列对比图。红色方块表示被删除的碱基。（B）Ppm1l缺乏会降低CT26细胞中的PD-L1表达。对WT和两个独立的Ppm1l-KO CT26系中的内源性mPD-L1进行免疫印迹分析。GAPDH作为加载对照。（C）PPM1L的恢复可使Ppm1l-KO CT26细胞中的PD-L1水平恢复正常。（D）皮下CT26同基因肿瘤模式的示意图（使用BioGDP.com创建）。在指定的时间点给予抗PD-1抗体（每只小鼠每次剂量200 μg），并连续监测肿瘤体积。（E）Ppm1l缺乏使肿瘤对反PD-1免疫疗法更敏感。根据每2-3天测量的肿瘤体积生成肿瘤生长曲线。所有标记的p < 0.05表示组间差异具有统计学意义。（F）终点肿瘤重量的定量分析证实，PPM1l敲除显著减少了肿瘤负担，并进一步提高了抗PD-1联合疗法的疗效。所有p < 0.05表示各组之间存在统计学上的显著差异。数据以平均值±SEM表示。（G）从四个实验组中收集的肿瘤图像。接下来，我们评估了这些细胞在具有免疫能力的BALB/c小鼠中的致瘤潜力。WT和Ppm1l-KO CT26细胞被皮下接种到小鼠体内，并持续监测肿瘤生长（图5D）。对肿瘤体积和最终肿瘤重量的定量分析显示，Ppm1l-KO肿瘤的生长速度明显慢于WT对照肿瘤（图5E–5G）。这些体内结果表明，在完整的免疫微环境中，PPM1L的缺失限制了肿瘤的进展。为了进一步确定PPM1l缺乏是否使肿瘤对反PD-1免疫疗法更敏感，我们对携带肿瘤的小鼠进行了抗PD-1免疫疗法处理。值得注意的是，PPM1l缺乏与抗PD-1联合治疗比单独使用任一疗法都具有更强的肿瘤抑制效果（图5E–5G）。总体而言，这些体内功能检测表明，PPM1l的缺失增强了PD-1免疫检查点阻断的疗效，凸显了PPM1B作为提高结肠癌免疫疗法反应性的有希望的治疗靶点。PPM1L和SERPINB1的临床意义为了研究PPM1L和PD-L1在肿瘤中的相关性和临床意义，我们首先分析了它们在多种癌症类型中的表达情况。具体来说，癌症基因组图谱（TCGA）的数据表明，PPM1L的转录与CD274（PD-L1）在几种癌症中的表达呈正相关（图S5A和S5B）。为了在蛋白质水平上验证这种转录相关性，我们进一步检查了19例结直肠癌患者的临床组织样本，发现PD-L1蛋白表达与PPM1L之间存在显著的正相关（图6A和6B）。图6 PPM1L和SERPINB1的临床意义显示完整标题 图片查看器（A和B）CRC肿瘤组织中PPM1L的蛋白表达与PD-L1呈正相关。（C和D）HNSC（C）和BLCA（D）中PPM1L的表达与CD8+ T细胞浸润呈负相关。（E和F）BLCA（E）和BRCA（F）中PPM1L的表达与免疫评分呈负相关。（G）LUSC中PPM1L的表达与肿瘤纯度呈正相关。（H）PPM1L的表达与肿瘤组织中的IFNG呈负相关。（I）与相邻正常组织相比，BRCA肿瘤组织中SERPINB1的表达显著下调。n：患者数量；n（肿瘤）= 118，n（相邻正常）= 18。（J）高SERPINB1表达与乳腺癌患者的总体生存期（OS）相关。n = 1,880。（K–M）SERPINB1的表达与BLCA（K，n = 406）、UVM（L，n = 80）和GBM（M，n = 287）中CD8+ T细胞浸润呈正相关。鉴于PD-L1在肿瘤免疫微环境中的重要作用，我们随后使用TIMER算法探讨了PPM1L与免疫细胞浸润之间的联系。我们观察到PPM1L的表达与CD8+ T细胞的浸润显著相关（图6C、6D和S5C）。进一步分析显示，PPM1L的表达与各种肿瘤中的免疫评分呈负相关（图6E、6F、S5D和S5E），而肿瘤纯度则呈正相关（图6G和S5F）。同时，我们还发现PPM1L的表达与免疫微环境中的IFNG呈负相关（图6H和S5G）。总体而言，这些数据表明PPM1L、PD-L1和肿瘤免疫浸润在临床上可能存在关联。此外，多项研究表明SERPINB1在各种恶性肿瘤（如胶质瘤、卵巢癌、前列腺癌和肝细胞癌（HCC）中具有肿瘤抑制作用。它们的表达显著下调不仅促进了肿瘤的进展，还与患者预后不良密切相关。在这里，我们通过比较临床蛋白质组学肿瘤分析联盟（CPTAC）蛋白质组学数据库的数据，观察到乳腺癌（BRCA）、头颈鳞状细胞癌（HNSC）、肺鳞状细胞癌（LUSC）和胰腺导管腺癌（PDAC）中的SERPINB1蛋白水平显著低于正常组织（图6I和S5H–S5J）。此外，Kaplan-Meier Plotter数据库的数据表明，高SERPINB1表达与BRCA患者的良好生存期相关（图6J）。这些数据共同表明，SERPINB1的丢失可能参与了这些癌症类型的发生和发展。鉴于SERPINB1负调节PD-L1表达，我们研究了SERPINB1表达与CD8+ T细胞浸润之间的潜在关系。与该调控轴一致，SERPINB1的表达与多种癌症类型中的CD8+ T细胞丰度显著正相关，特别是膀胱尿路上皮癌（BLCA）、葡萄膜黑色素瘤（UVM）、胶质母细胞瘤多形性（GBM）、皮肤黑色素瘤（SKCM）和肾色素细胞癌（KICH）（图6K–6M、S5K和S5L）。讨论动态磷酸化是调节PD-L1稳定性的关键蛋白修饰（PTM），这一过程与对反PD-1/PD-L1免疫疗法的持久反应密切相关。越来越多的证据表明，不同激酶介导的PD-L1磷酸化在控制其稳定性方面起着关键作用。在本研究中，我们证明了由磷酸酶PPM1L控制的PD-L1磷酸化状态以癌症类型特异性的方式调节其被各种E3蛋白连接酶（ARIH1、RNF2和RING1）的识别。后续分析确定SERPINB1是一种调节PD-L1的因子，它控制ARIH1介导的降解。总体而言，这些发现描绘了调控PD-L1稳态的机制，并揭示了精准治疗的潜力。据报道，PD-L1被多种E3蛋白连接酶（例如ARIH1、β-TrCP和Cul3SPOP）通过泛素化途径降解。在本研究中，我们进一步确定了RNF2和RING1以及ARIH1作为识别PD-L1在S279/283位点磷酸化的E3蛋白连接酶。值得注意的是，不同癌症类型中由不同E3蛋白连接酶介导的PD-L1调控模式的不同，突显了精准治疗在抑制癌症免疫逃逸中的重要性。因此，精确靶向单个E3蛋白连接酶或组合靶向多个E3蛋白连接酶可能具有增强抗肿瘤免疫反应的巨大潜力。值得注意的是，尽管PPM1L缺乏引起的PD-L1与E3泛素连接酶ZNF598和COP1之间的相互作用在RKO细胞中尚未得到验证，但它们与PD-L1的相互作用及其潜在的调控作用可能发生在其他细胞环境中。作为关键的PTM之一，磷酸化是控制PD-L1稳定性的核心调控机制。例如，GSK3ɑ磷酸化PD-L1的S279和S283位点，而AMPK特异性地介导S195位点的磷酸化。因此，针对这些激酶及其上游通路的策略已成为肿瘤治疗中的有吸引力的策略。一致的是，专注于调节PD-L1磷酸化的策略在多种肿瘤类型中具有相当大的治疗潜力。在这项研究中，我们确定了磷酸酶PPM1L作为PD-L1磷酸化和稳定性的上游调节因子，揭示了以前未被充分认识的PD-L1翻译后调控机制。未来的研究关注PPM1L及其相关调控网络，可能会进一步扩展PD-L1靶向免疫疗法的临床转化前景。值得注意的是，先前已有报道指出PPM1L在特定实验条件下具有潜在的肿瘤抑制作用。我们目前的发现进一步揭示了PPM1L在肿瘤进展中的关键免疫调节作用。这种双重功能特性主要由PPM1L下游底物的多样性决定。因此，PPM1L的总体生物学效应在不同背景下有很大差异，取决于特定的癌症类型、疾病进展阶段、内在分子特征以及肿瘤免疫微环境的动态状态。此外，我们还发现SERPINB1调节PD-L1的稳定性，揭示了其与抗肿瘤免疫反应的相互作用。先前的研究表明，Th17细胞中的SERPINB1表达由IL-2中和和缺氧刺激诱导——这两种微环境信号在肿瘤中非常普遍。未来研究探索癌细胞中是否存在类似的SERPINB1调节及其在调节抗肿瘤免疫反应中的潜力将非常有趣。总结来说，我们的研究建立了一个全面的PD-L1稳定性调控网络，其中PPM1L、一系列E3蛋白连接酶和SERPINB1作为核心调节因子。这些发现推进了我们对PD-L1翻译后调控机制的理解，强调了精准治疗策略的重要性，并提供了有效的癌症免疫疗法的潜在靶点。研究的局限性然而，在解释我们的发现时，应考虑几个限制因素。首先，PPM1L具有双重肿瘤抑制和免疫调节作用，其生物学功能在不同的癌症亚型、疾病阶段和肿瘤微环境中有所差异。鉴于这种异质性，需要严格评估与PPM1L靶向相关的脱靶风险。其次，PPM1L缺失与PD-1阻断联合使用的协同抗肿瘤疗效仅在同基因小鼠肿瘤模型中进行了验证。需要使用原发性人类肿瘤组织和前瞻性临床试验来进一步验证PPM1L靶向的转化潜力。资源可用性有关资源和试剂的更多信息及请求应联系主要联系人Haiyan Ren（[e-mail]）。材料可用性本研究未生成新的、独特的试剂。数据和代码可用性•质谱数据已存入集成蛋白质组资源（iProX），访问号为PXD073049，并且可以公开获取。本文未报告其他新的标准化类型的数据集。•本文未报告原始代码。•如需重新分析本文报告的数据，可向主要联系人请求额外的信息。致谢本项工作得到了中国国家自然科学基金（H.Y.的32271315项目）、国家杰出青年科学基金（W.C.的32225001项目）、国家自然科学基金青年科学家基金（F.C.的32400578项目）、四川省自然科学基金青年科学家项目（F.C.的2025ZNSFSC1093项目）、四川大学西华医院优势学科1.3.5项目（H.Y.的ZYYC23021项目和W.C.的ZYGD23018项目）的支持。我们感谢西华医院质谱中心的成员（Rui Wang和Xiyu Wu）提供的蛋白质组技术和数据解读。作者贡献P.L.和X.L.设计并执行了实验。P.H.和Z.Z.进行了实验。P.L.、X.L.和P.H.撰写了手稿。H.Y.和W.C.设计了实验并分析了结果。H.Y. 负责了所有项目的协调工作，撰写了手稿并筹集了资金。作者声明没有利益冲突。

**STAR★ 方法**

**关键资源表**

| 抗体 | RRID | Catalog # |
|--|--|--|
| 兔抗PD-L1抗体 | CSTRID: AB_2687655; Catalog # 13684 |
| Flag标签（3B9）小鼠mAb抗体 | AbmartRRID: AB_2713960; Catalog #M20008 |
| 兔抗PPM1L抗体 | R&DRRID: AB_10992922; Catalog # MAB6914 |
| 兔抗ARIH1抗体 | ABclonalRRID: AB_2768438; Catalog # A17123 |
| 兔抗RING1抗体 | AbmartRRID: AB_3739474; Catalog #T58151 |
| 兔抗RNF2抗体 | AbmartRRID: AB_3739472; Catalog #T58108 |
| 兔抗SERPINB1抗体 | AbclonalRRID: AB_2766864; Catalog # A6257 |
| 兔抗MHC-I抗体 | HUABIORRID: AB_3070309; Catalog # ET1702-47 |
| PD-L1重组兔单克隆抗体 | HUABIORRID: AB_3752582; Catalog # HA722184 |
| 兔抗GAPDH抗体 | AbclonalRRID: AB_2736879; Catalog # AC002 |
| 兔抗钠钾ATP酶抗体 | AbcamRRID: AB_1310695; Catalog # ab76020 |
| 组蛋白H3多克隆抗体 | ProteintechRRID: AB_2716755; Catalog # 17168-1-AP |
| 兔抗HA抗体 | AbcamRRID: AB_307019; Catalog # ab9110 |
| 兔抗Flag抗体 | ImmunowayRRID: AB_3752716; Catalog # YM3809 |
| 兔抗Strep II抗体 | HUABIORRID: AB_2904531; Catalog #HA500061 |
| Ub (P4D1)小鼠抗体 | Santa Cruz BiotechnologyRRID: AB_628423; Catalog # sc-8017 |
| 兔抗Ub抗体 | ProteintechRRID: AB_2923694; Catalog # 80992-1-RRK48 |
| 链接特异性多聚泛素兔抗体 | CSTRID: AB_10859893; Catalog # 8081 |

**HRP结合山羊抗兔IgG（H + L）** | ProteintechRRID: AB_2722564; Catalog # SA00001-2 |
**HRP结合山羊抗鼠IgG（H + L）** | ThermofisherRRID: AB_228307; Catalog # 31430 |
| APC抗人CD274** | BiolegendRRID: AB_940360; Catalog # 329708 |
| APC小鼠IgG2b** | BiolegendRRID: AB_326500; Catalog # 400322 |
| 抗鼠PD-1（CD279）-InVivo** | SelleckRRID: AB_3644244; Catalog # A2122 |
| 山羊抗鼠高效交联Alexa Fluor Plus 488** | ThermofisherRRID: AB_2633275; Catalog # A32723 |
| 山羊抗人IgG（H + L）高效交联Alexa Fluor Plus 488** | ThermofisherRRID: AB_141360; Catalog # A11013 |
| Pan-Phospho-丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸抗体** | AbmartRRID: AB_2936271; Catalog #M210030 |

**化学品、肽和重组蛋白**

| 化学品 | SelleckCAS # | Code |
|--|--|
| 杜卡霉素 | CHXSelleck | CAS #66–81–9 |
| 氯喹 | MCECAS | #11089–65–9 |
| 番柔霉素 | MCECAS | #HY-A0098 |
| MG132 | Selleck | #1211877–36–9 |
| 氯喹 | MCECAS | #HY-17589 |
| 链霉素 | MCECAS | #58–58–2 |
| AG418 | Basalmedia | #108321–42–2 |
| J7脂质体 | Thermofisher | #11668019 |
| PEI | Polysciences | #24765–2 |
| 紫霉素B | Basalmedia | #S160J7 |
| LipoPlus | Sagecreation | #Q03003 |

**重组人PD-1 Fc嵌合蛋白** | R&D | #1086-PDKO |
| DNA聚合酶 | TOYOBO | #KMM-101 |
| 测序级改良胰蛋白酶 | Promega | #V5117 |
| 重组人IL-2蛋白 | MCE | #HY-P7037 |

**生物试剂**

| 来源 | RRID | Catalog # |
|--|--|
| PD-L1重组兔单克隆抗体 | HUABIO | #AB_3752582 | Catalog # HA722184 |
| 抗鼠GAPDH抗体 | Abclonal | #AB_2736879 | Catalog # AC002 |
| 抗钠钾ATP酶抗体 | Abcam | #AB_1310695 | Catalog # ab76020 |
| 组蛋白H3多克隆抗体 | Proteintech | #AB_2716755 | Catalog # 17168-1-AP |
| 抗HA抗体 | Abcam | #AB_307019 | Catalog # ab9110 |
| 抗Flag抗体 | Immunoway | #AB_3752716 | Catalog # YM3809 |
| 抗Strep II抗体 | HUABIO | #AB_2904531 | Catalog # HA500061 |
| Ub (P4D1)小鼠抗体 | Santa Cruz Biotechnology | #AB_628423 | Catalog # sc-8017 |
| 抗Ub抗体 | Proteintech | #AB_2923694 | Catalog # 80992-1-RRK48 |
| 连接特异性多聚泛素兔抗体 | CSTRID | #AB_10859893 | Catalog # 8081 |
| HRP结合山羊抗鼠IgG（H + L） | Proteintech | #AB_2722564 | Catalog # SA00001-2 |
| HRP结合山羊抗鼠IgG（H + L） | Thermofisher | #AB_228307 | Catalog # 31430 |
| APC抗人CD274 | Biolegend | #AB_940360 | Catalog # 329708 |
| APC小鼠IgG2b | Biolegend | #AB_326500 | Catalog # 400322 |
| 抗鼠PD-1（CD279）-InVivo | Selleck | #AB_3644244 | Catalog # A2122 |
| 山羊抗人IgG（H + L）高效交联Alexa Fluor Plus 488 | Thermofisher | #AB_2633275 | Catalog # A32723 |
| 抗鼠PD-1（CD279）-InVivo | Thermofisher | #AB_141360 | Catalog # A11013 |
| Pan-Phospho-丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸抗体 | Abmart | #AB_2936271 | Catalog #M210030 |

**实验模型和生物样本**

| 细胞系 | RRID | Catalog # |
|--|--|
| HEK 293T | CVCL_0504 | #TCHu116 |
| HEK 293TN | CVCL_0063 | #GNHu17 |
| MDA-MB-231 | CVCL_0062 | #TCHu227 |
| Huh-7 | CVCL_0336 | #SCSP-526 |
| A375 | CVCL_0132 | #TCHu155 |
| CT26 | CVCL_7254 | #SCSP-523 |
| SK-MEL-28 | CVCL_0526 | #TCHu286 |
| 人外周血单核细胞（PBMC） | | | |

**实验动物和细菌株**

| DH5α | Tsingke Biotechnology | #TSV-A07 |
| 结直肠癌（CRC）患者肿瘤组织 | West China Hospital, Sichuan University | |

**重组DNA和衍生物（质粒）**

| pCMV及衍生物（质粒） | | |
| ApLKO.1及衍生物（质粒） | | |
| PPM1L | | |
| ARIH1 | | |
| RING1 | | |
| RNF2 | | |

**基因和蛋白质信息**

| 基因ID | NCBI | ID |
|--|--|
| PD-L1 | NCBI | 29126 |
| PPM1L | NCBI | 15174 |
| SERPINB1 | NCBI | 1992 |
| ARIH1 | NCBI | 2582 |
| RING1 | NCBI | 6015 |
| RNF2 | NCBI | 6045 |
| VAPA | NCBI | 9218 |

**软件和算法**

| Adobe Illustrator 2020 | | SCR_010279; http://ai.sjzwlqtwo.cn/?qhclickid=SATss21102162005 |
| Maxquant 1.6.2.3 | | SCR_014485; http://www.biochem.mpg.de/5111795/maxquant |
| 其他 | | |

**实验设备和试剂**

| 抗Flag亲和凝胶 | MCE | #HY-K0217 |
| 抗StrepII琼脂糖珠 | MCE | #HY-K0239 |
| Fe-NTA珠 | Thermofisher | #A32992 |
| ECLwestern印迹底物 | Bio Rad | #1705061 |
| 抗人CD3/CD28珠 | Novoprotein | #GMP-B038 |
| 人淋巴细胞分离培养基 | Dakewe Biotech | #711101 |
| X-VIVO15无血清造血细胞培养基 | Lonza | #BE02-060F |
| 细胞总RNA分离试剂盒 | FOREGENE | #RE-03111 |
| ClonExpress II一步克隆试剂盒 | Vazyme | #C112-01 |
| DAPI Mounting Medium | Abcam | #ab104139 |
| SuperView? 488 Caspase-3活性测定试剂盒 | Yeasen | #40273 |
| 4%甲醛固定液 | Sangon Biotech | #E67200 |

**实验模型和参与者详情**

细胞培养和转染：HEK 293T、A375、SK-MEL-28、Huh-7和HCT 116细胞来自由国家认证的细胞库。RKO和MDA-MB-231细胞购自iCell Bioscience Inc。所有细胞系均在含有10%胎牛血清（FBS）和100 U/mL青霉素-链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中培养，并在含5% CO2的湿润空气中37°C下孵育。人外周血单核细胞（PBMCs）来自健康女性捐赠者，培养基中添加了10%胎牛血清（FBS）、抗人CD3/CD28珠和白细胞介素-2，在5% CO2空气中37°C下培养以诱导T细胞活化。所有培养的细胞系均定期检测并确认无支原体污染。HEK 293T细胞使用聚乙烯亚胺（PEI）转染；RKO和CT26细胞使用Lipofectamine2000转染，其余肿瘤细胞系使用Lipoplus转染，具体操作遵循制造商说明。

**实验动物**

5周龄的BALB/c小鼠购自GemPharmatech（南京），在特定无病原体（SPF）环境中适应一周后进行实验。动物每笼最多五只，提供标准饲料和自由饮水。为了建立肿瘤模型，收集野生型或Ppm1l敲除的CT26细胞，以8×10^5细胞/100 μL的浓度悬浮在DMEM中，皮下注射到每只小鼠的右胁部。为了评估PD-1阻断的效果，给予每只小鼠200 μg剂量的抗鼠PD-1抗体，首次接种后第11天开始，后续每2-3天重复一次。使用数字卡尺每2-3天监测肿瘤生长，体积计算公式为：体积（mm^3）= π/6 × 长度 × 宽度^2。处死时解剖并称重肿瘤。所有操作均符合四川大学西华医院动物伦理委员会的批准指南（批准号20240301110）。

**方法细节**

**质粒**

pcDNA3.1-PD-L1-Flag、pcDNA3.1-PD-L1-Flag-PafA和pEF6a-BCCP-Pup(E)质粒来源于我们之前的研究。PPM1L、ARIH1、RING1、RNF2、ZNF598、COP1、VAPA和SERPINB1基因从HEK 293T、HCT 116或RKO细胞的cDNA文库中扩增并克隆到pCMV或pcDNA3.1表达载体中。通过定向突变引入PD-L1、PPM1L和ARIH1的点突变。设计针对SERPINB1或Ppm1l基因的单引导RNA（sgSERPINB1, 5′-TTGAGTGAGAACAATCCGGC-3′或sgPpm1l, 5′-CGTTAAGTCTAGCCGGGACG-3′）并克隆到PX330载体中，构建PX330-sgSERPINB1或sgPpm1l质粒。使用以下引物扩增SERPINB1的同源重组臂：左侧臂为5′-AGAGACGATTTCACAACAAGGAG-3′和5′-CCATGGTGAAAACTGCAACAC-3′；右侧臂为5′-TTTTTCTGGGGACCAGAGGTAAC-3′和5′-CTTTTACCACTCCTTTCTGCTGAG-3′，构建PUC19-SERPINB1质粒。使用以下引物扩增PPm1l的同源重组臂：左侧臂为5′-ATCGTGCTGCGTTTCCCAGC-3′和5′-GAAGAAGTAACTCCAGAGAGCCAAGCTG-3′；右侧臂为5′-AGGTGGCCGAGATTATGCAGAAC-3′和5′-CCACGTCCTATGGCTCTAGCAAAG -3′，构建PUC19-Ppm1l质粒。为了敲低PPM1L（第一条线为5′-GCATCATGCGCTACTTCTTGC-3′，第二条线为5′-GCTTGGATGAACCTCACTTTG-3′）、ARIH1（第一条线为裂解液在4°C下以15,000×g的离心力离心15分钟，然后将上清液与抗Flag或抗StrepII亲和珠在4°C下孵育3-4小时，期间轻轻旋转。用裂解缓冲液清洗珠子三次，在95°C下用SDS加载缓冲液煮沸10分钟。

检测膜PD-L1：
细胞在含有1%蛋白酶抑制剂的HDB缓冲液（140 mM NaCl、5 mM KCl、12.5 mM HEPES、0.5 mM EDTA、5 mM MgCl2、pH 7.5）中进行冻融处理。样品在4°C下以15,000×g的离心力离心15分钟。向沉淀物中加入膜提取缓冲液（1.5 mM NaCl、50 mM HEPES、1.5 mM MgCl2、1 mM EGTA、10%甘油、1% Triton X-100、pH 7.5），然后在冰上孵育30分钟。裂解液在4°C下以15,000×g的离心力离心15分钟。上清液在37°C下用SDS加载缓冲液变性后，通过免疫印迹进行分析。

通过流式细胞术评估RKO细胞表面的PD-L1表达水平。具体步骤为：收集细胞，用预冷的PBS洗涤两次，然后重新悬浮在200 μL的PBS中。将样品与辣根过氧化物酶（APC）标记的抗PD-L1单克隆抗体在室温下黑暗条件下孵育30分钟。洗涤一次以去除未结合的抗体，使用流式细胞仪测量荧光强度。

核质分离：
细胞在含有1%蛋白酶抑制剂的细胞质提取缓冲液（50 mM Tris-HCl、pH 8.0；10 mM NaCl；5 mM MgCl2；0.3% NP-40）中在冰上裂解10分钟。在4°C下以500×g的离心力离心5分钟后，收集上清液，并再次以15,000×g的离心力离心5分钟以去除细胞碎片，从而获得细胞质部分。沉淀物用细胞质提取缓冲液清洗三次，然后重新悬浮在含有1%蛋白酶抑制剂的核提取缓冲液（20 mM HEPES、pH 7.5；0.5 M NaCl；1 mM DTT；1 mM EGTA）中，在4°C下轻轻振荡20分钟。裂解液随后在4°C下以15,000×g的离心力离心30分钟，收集上清液作为核部分。

免疫印迹：
样品在SDS-PAGE凝胶上分离后转移到0.45 μm PVDF膜上。用含有5%脱脂牛奶或BSA的TBST缓冲液在室温下封闭膜2小时。将膜与适当的一抗在4°C下孵育过夜。用TBST清洗三次后，与二抗在室温下孵育1-2小时，使用SageCapture成像系统检测信号。

PD-1结合实验：
RKO细胞用PBS洗涤后重新悬浮在染色缓冲液（#420201，BioLegend）中。将样品与5 μg/mL的重组人PD-1-Fc融合蛋白在室温下孵育30分钟。洗涤三次后，样品与Alexa Fluor Plus 488标记的抗人二抗在室温下孵育30分钟，然后使用流式细胞仪进行分析。

T细胞活化及细胞毒测定：
通过离心（1000 × g，30分钟）从志愿者外周血中分离外周血单核细胞（PBMCs）。收集单核细胞层，用X-VIVO15培养基洗涤，然后以300 × g的离心力在室温下离心10分钟。沉淀物用红细胞裂解缓冲液处理，再以300 × g的离心力离心5分钟。细胞在含有20 ng/mL重组人IL-2和10% FBS的20 mL X-VIVO15培养基中培养，并在37°C、5% CO2条件下使用抗人CD3/CD28 Dynabeads活化48小时。活化的T细胞与RKO细胞以5:1的比例（T细胞:癌细胞）共培养24小时。用PBS轻轻洗涤去除非贴壁细胞和碎片。将细胞在37°C下与荧光caspase-3/7活性探针孵育1小时，使用IncuCyte仪器进行显微成像。凋亡细胞（caspase-3/7阳性）通过荧光显微镜定量。

临床信息：
来自四川大学华西医院的结直肠癌（CRC）患者的肿瘤组织样本被用于我们之前的研究。该研究获得了四川大学华西医院研究伦理委员会的批准（批准编号：2020 (374)），并遵循《赫尔辛基宣言》中的伦理原则进行。所有患者在参与研究前均已获得知情同意，并经过彻底审核和记录。

数据分析和统计比较：
数据分析和统计比较使用GraphPad Prism 6完成。量化数据以平均值±标准误差（SEM）表示。使用单尾学生t检验评估两个独立组之间的差异。p值小于0.05被认为具有统计学意义。

补充信息（2）
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