凋亡抑制将肺泡肌成纤维细胞重编程为导管肌成纤维细胞

《Cell Reports》：Apoptosis inhibition reprograms alveolar myofibroblasts toward ductal myofibroblasts

　　

肺的上皮树由气道平滑肌细胞（ASMCs）、导管肌成纤维细胞（DMFs）以及瞬时存在的肺泡肌成纤维细胞（AMFs）沿近端-远端轴向塑造。谱系示踪和快照成像提示AMFs在肺泡化完成后通过凋亡被清除，但缺乏确凿证据。在此，研究人员构建了一种诱导型BCL2过表达小鼠等位基因以抑制AMF凋亡。利用三个独立的Cre驱动因子和单细胞RNA测序（scRNA-seq），研究人员发现BCL2挽救的AMFs持续存在于远端肺泡导管和肺泡周围，并出乎意料地向DMFs方向成熟。在尘螨（HDM）诱导的哮喘模型中，正常DMFs和挽救的DMF样细胞均上调收缩蛋白。研究结果表明，凋亡是AMF清除的主要机制，并揭示了上皮轴肺间充质细胞的命运可塑性和病理生理趋同性。

**研究背景**

肺发育依赖于上皮树周围多种间充质细胞的协同作用。研究人员前期利用单细胞RNA测序（scRNA-seq）和三维成像将小鼠肺间充质细胞分为血管轴、上皮轴和间质轴三大类群。其中上皮轴包括气道平滑肌细胞（ASMCs）、导管肌成纤维细胞（DMFs）和肺泡肌成纤维细胞（AMFs）；AMFs以高表达PDGFRA为特征，是新生儿肺泡化期间次级分隔所必需的瞬时收缩细胞，在肺泡化完成后消失。既往谱系示踪实验排除了AMFs转分化为其他肺间充质细胞类型的可能，而凋亡标志物（如cleaved Caspase-3）在P12-P13的AMFs中达峰，提示凋亡参与AMF清除。然而，由于凋亡具有异步性和吞噬清除迅速的特点，单时间点快照仅能捕获极少数凋亡细胞，缺乏直接证据证明凋亡对AMF群体的累积清除效应。为此，研究人员构建了诱导型BCL2过表达小鼠模型，系统抑制AMF凋亡，探究AMF的最终命运及其病理生理意义。

**研究内容与结论概况**

研究人员构建了定位于ROSA26位点的FLP和Cre双条件诱导型FLAG标记人BCL2过表达等位基因（ROSABCL2+F），经ROSAFlp去除FRT-flanked转录终止盒后获得Cre依赖性ROSABCL2等位基因。利用PdgfraCreER、Myh11-CreER和PdgfrbCreER三个独立Cre驱动因子在P8单次注射他莫昔芬诱导AMFs中BCL2过表达，结合谱系示踪、免疫染色、Western blot和scRNA-seq分析，发现BCL2挽救的AMFs持续存在于远端肺泡导管和肺泡周围，并出乎意料地成熟为DMFs。在尘螨（HDM）诱导的哮喘模型中，正常DMFs和挽救的DMF样细胞均上调收缩蛋白。该研究证明凋亡是AMF清除的主要机制，并揭示上皮轴肺间充质细胞的命运可塑性和病理生理趋同性，发表在《Cell Reports》。

**主要技术方法**

研究人员主要采用了以下关键技术：构建Cre/Flp诱导型BCL2过表达小鼠模型（ROSABCL2）；使用PdgfraCreER、Myh11-CreER（Y连锁，仅用雄性）和PdgfrbCreER三种独立Cre驱动因子进行细胞类型特异性基因操作；利用ROSA26-tdTomato报告基因进行谱系示踪；对FACS分选的肺细胞进行scRNA-seq（10x Genomics平台，Seurat 5.0分析）；结合免疫荧光染色、Western blot、TUNEL凋亡检测、Monocle2轨迹分析、CellChat配体-受体分析及HDM诱导的过敏性哮喘模型进行功能验证。

**研究结果**

**1. 诱导型BCL2过表达模型以细胞特异性方式抑制凋亡**

研究人员首先在ShhCre驱动的全肺上皮中验证等位基因活性，FLAG-BCL2正确表达于NKX2-1+上皮细胞并与线粒体标志物TOMM20共定位；ShhCre同时靶向后肢第四、五指，导致四趾间蹼状表型，重现了Bax/Bak双突变体中经典的发育凋亡失败表型，证明该模型可在体内诱导性阻断发育性凋亡。PdgfraCreER在P8诱导后，91%的PDGFRA-high AMFs被标记，15%的HHIP+ DMFs和25%的MEOX2+ AF1s被标记，显示其对AMFs的高效靶向性。BCL2过表达使cleaved Caspase-3+和TUNEL+的AMFs显著减少，证实凋亡被有效抑制。

**2. PdgfraCreER驱动的BCL2过表达抑制AMFs凋亡**

在P12时间点，BCL2过表达组中PDGFRA-high细胞的cleaved Caspase-3阳性率显著低于对照组（p=0.0022），TUNEL+细胞数也显著减少（p=0.0002）。谱系示踪显示BCL2组中谱系标记细胞和间充质细胞总数增加，表明累积性BCL2保护挽救了本该发生凋亡的AMFs。

**3. 持续性AMFs在远端肺泡导管和肺泡周围被重编程为DMF命运**

在P35成熟肺中，对照组92%的tdT+细胞为MEOX2+ AF1s，而BCL2组仅56%的tdT+细胞为AF1s，其余为逃脱凋亡的持续性AMFs（MEOX2-）。这些细胞不表达血管轴标志物PDGFRB和NOTCH3，也不表达高水平的PDGFRA。约半数持续性AMFs异位表达DMF标志物HHIP和CDH4（命名为DMF样细胞），其余为HHIP-MEOX2-的SCMF样细胞。BCL2组HHIP+细胞比例从对照组的3%上升至16%，其中70%为FLAG+DMF样细胞。时间序列分析显示DMF样细胞比例随发育进程逐渐增加，与AMF正常清除的时间窗吻合。空间上，对照组HHIP+ DMFs局限于近端肺泡导管（距终末细支气管2-3个分支代），而BCL2组DMF样细胞扩展至远端肺泡导管并伴随粗弹性纤维，SCMF样细胞则位于更远端的肺泡区。尽管弹性纤维面积增加，肺泡形态和肺力学参数（平均线性截距、肺泡壁厚度、FlexiVent测量）均未受影响。

**4. scRNA-seq将持续性AMFs鉴定为DMF样和SCMF样细胞**

P38肺的scRNA-seq分析显示，BCL2组出现两个仅存在于BCL2肺中的异位细胞群，与DMFs邻近，分别为SCMF样细胞（高Pdgfra、低Hhip）和DMF样细胞（低Pdgfra、高Hhip），两者均表达AMF/DMF共有标志物Egfem1和Tgfbi。WPRE作为谱系标记（存在于tdT和BCL2等位基因的3‘-UTR）确认这些细胞来自PdgfraCreER谱系，Meox2阴性排除了AF1/AF2来源。Monocle2轨迹分析显示SCMF样→DMF样→DMF的转录连续体，SCMF样细胞富集核糖体基因（未成熟状态特征）。整合发育时间序列数据（P7、P13、P20）后，持续性AMFs与P7/P13的发育性AMFs聚类；BCL2挽救的AMFs上调DMF标志物（Hhip、Cdh4、Cxcl14等）并下调收缩基因（Tagln、Acta2），支持其向DMF命运的重编程。BCL2组上皮轴细胞整体富集核糖体基因和mRNA加工/翻译通路，而对照组富集细胞外基质和收缩相关通路。

**5. 另外两个Cre驱动因子重现持续性AMF表型**

Myh11-CreER特异性靶向收缩细胞（VSMCs、ASMCs、DMFs、AMFs和血管周细胞），排除AF1s和AF2s。该模型中，P21和成年肺均观察到HHIP+细胞向远端肺泡导管的显著扩展，scRNA-seq确认了与PdgfraCreER模型相同的SCMF样和DMF样细胞群，两组持续性AMFs的基因表达相关性达R2=0.99。PdgfrbCreER（传统认为特异性靶向VSMCs和血管周细胞，但也标记AF2s和AMFs）同样重现该表型，基因表达相关性R2=0.97。由于三个驱动因子在肺中唯一重叠的靶细胞群就是经历凋亡清除的AMFs，这从遗传学上确证了持续性细胞来源于BCL2挽救的AMFs。

**6. DMFs和DMF样细胞在HDM暴露后均上调收缩基因**

在3周HDM诱导的过敏性哮喘模型中，成年肺中已下调收缩基因的DMFs（HHIP+）重新激活ACTA2和TAGLN表达，该反应仅限于沿近端肺泡导管的HHIP+细胞。在Myh11-CreER；ROSABCL2肺中，表达收缩基因的细胞扩展至远端肺泡导管，为HHIP+tdT+的DMF样细胞；而SCMF样细胞（HHIP-tdT+）和血管周细胞（PDGFRB+tdT+）均无此反应。这揭示了DMFs对过敏性炎症的先前未被认识的反应，并表明DMFs与持续性AMFs在此病理情境下发生功能趋同。

**讨论与结论**

讨论部分指出，该BCL2诱导型过表达模型是研究体内凋亡的通用工具。AMF凋亡可能由收缩诱导的耗竭或细胞外基质/邻近细胞生存信号缺失所触发，BCL2过表达足以抑制该过程。AMFs向DMF命运的重编程支持肺间充质细胞三轴分类模型；细胞死亡是限制细胞可塑性、终结发育程序的最终手段。DMFs在哮喘模型中重新激活收缩基因，提示未成熟肺中仍具收缩性的DMFs可能使儿童对哮喘触发因素更敏感；每个间充质细胞轴可能对不同肺疾病有独特贡献（上皮轴-哮喘、血管轴-肺动脉高压、间质轴-肺纤维化）。研究局限性包括缺乏AMF特异性标志物和驱动因子、BCL2模型为双重组酶系统、凋亡上游机制未明、DMF样/SCMF样命运选择的机制基础以及DMFs在气道力学中的功能作用仍需进一步研究。

研究结论：凋亡是AMF清除的主要机制；BCL2挽救的AMFs展现出向DMF命运的细胞可塑性；在HDM诱导的哮喘模型中，正常DMFs和挽救的DMF样细胞均上调收缩蛋白，体现了上皮轴肺间充质细胞的病理生理趋同性。