巨量ANK2缺失猴的纵向特征分析提示神经发育障碍样表型

《Research》：Longitudinal Characterization of Giant ANK2-Depleted Monkeys Suggests Neurodevelopmental-Disorder-Like Phenotypes

　　

摘要：ANK2基因突变是孤独症谱系障碍（autism spectrum disorder, ASD）的显著风险因素，孤独症谱系障碍属于神经发育障碍（neurodevelopmental disorders, NDDs）的一种，常持续至成年期，且其病因复杂，涉及遗传与环境因素。ANK2编码两种主要亚型：AnkB-220（220-kDa ankyrin-B亚型）和巨量AnkB-440。研究人员此前在2只食蟹猴和2只恒河猴中建立了巨量AnkB-440的靶向敲除（knockout, KO）。虽然在婴儿期未观察到孤独症谱系障碍样表型，但研究人员发现了显著的脑容量减少。在本研究中，研究人员对处于青少年期和成年早期的巨量ANK2 KO猴开展了纵向多模态研究。行为学结果显示，这些巨量ANK2 KO猴表现出运动活动增加、认知缺陷（包括工作记忆、认知灵活性和操作性压杆学习能力受损）以及情绪调节和社交互动障碍。此外，巨量ANK2 KO猴表现出持续的结构性和功能性脑异常、脑甘油三酯（triglyceride, TG）和甘油磷脂（glycerophospholipid, GP）上调，以及外周血转录组特征提示免疫失调，这些改变可能与其行为异常相关。这些观察结果表明，非人灵长类中巨量ANK2缺失可复现NDDs特征性的行为、神经和分子表型。本研究提供了巨量ANK2在灵长类大脑中功能的深入探索性纵向特征分析，可能有助于NDDs的转化研究。

论文解读：巨量ANK2缺失猴的纵向特征研究揭示神经发育障碍样表型

一、研究背景与问题

人类神经发育是一个持续至成年期的漫长过程，该过程中的异常可导致神经发育障碍（neurodevelopmental disorders, NDDs），此类疾病源于发育期，并造成个人及社会功能缺陷。常见NDDs包括孤独症谱系障碍（autism spectrum disorder, ASD）、智力障碍（intellectual disability, ID）、注意缺陷/多动障碍及运动障碍，精神分裂症和神经系统畸形也被认为属于该谱系。NDDs病因复杂，涉及遗传与环境因素的交互作用。ANK2基因编码锚定蛋白B（ankyrin-B, AnkB），其两种主要亚型中，广泛表达的220-kDa亚型（AnkB-220）在树突棘中发挥功能，而神经元特异性440-kDa亚型（巨量AnkB-440）主要存在于无髓鞘轴突。已有研究明确ANK2基因突变是ASD的显著风险因素，并在伴有发育迟缓和智力障碍的NDD人群中富集。然而，既往研究几乎完全集中于AnkB-220序列内的突变，巨量ANK2亚型在神经系统中的功能在很大程度上未被探索。虽然啮齿类动物模型提示ANK2参与脊柱调控、神经突生长和轴突发育，但小鼠与人类在遗传和神经生物学方面存在显著种间差异，例如SHANK3或PINK1突变非人灵长类（non-human primates, NHPs）表现出小鼠模型中未见的神经元发育紊乱。此外，NDD症状通常在儿童晚期或青春期才完全显现，而这一发育阶段在啮齿类中明显压缩，在灵长类中则显著延长。因此，在NHPs中进行纵向研究对于准确描绘疾病全程至关重要。研究人员此前在恒河猴和食蟹猴中建立了巨量ANK2（AnkB-440）靶向敲除（knockout, KO）模型，发现这些KO猴在婴儿期即表现出显著的脑容量减少，但行为学评估未发现社交互动、探索或刻板行为、睡眠或活动水平的显著差异，这与小鼠模型的表现截然不同。这些缺陷是否持续或进行性加重，以及巨量ANK2缺失如何影响青春期和成年早期的大脑，成为亟待解决的问题。

二、研究内容与结论

基于婴儿期的观察，研究人员推测巨量ANK2缺失将在青春期至成年期驱动一系列行为、神经和分子改变。为此，研究人员对既往建立的巨量AnkB-440 KO猴（2只恒河猴、2只食蟹猴）从青春期追踪至成年早期，开展纵向多模态特征分析。研究共持续7年，综合运用人工智能驱动的三维运动识别、系列行为学范式、结构及静息态功能磁共振成像（MRI/rs-fMRI）、脑脊液和血清脂质组学、外周血转录组学等技术，并与年龄匹配的野生型（wild-type, WT）猴进行对照。研究结果显示，巨量ANK2 KO猴在青春期和成年期表现出多种NDD样表型：活动过度且无刻板行为，工作记忆、认知灵活性和操作性学习等多项认知功能受损，情绪调节异常（对恐惧刺激的回避反应缺失且无习惯化），社交互动缺陷（主动理毛减少、在群体中社会等级倾向偏低、在三箱社交测试中偏好非社会物体并回避同类）。影像学分析显示KO猴持续存在脑室扩大及枕叶、颞叶、后顶叶形态学改变，额叶多个区域灰质厚度（gray matter thickness, GMT）降低，苍白球体积减小，下丘脑和苍白球髓鞘化增加；静息态功能连接（functional connectivity, FC）在顶叶内及皮层-皮层下网络出现异常，额叶和皮层下区域功能连接密度（FCD）改变，脑网络小世界系数σ显著降低，提示网络整合与分离失衡。脑脊液脂质组学显示KO猴脑脊液中甘油三酯（triglyceride, TG）和甘油磷脂（glycerophospholipid, GP）显著上调，以TG为主，且特定链长和饱和度脂质种类增加。外周血转录组分析发现KO猴免疫相关基因表达失调，涉及细胞因子产生等通路，两个猴种间共享多个免疫相关差异表达基因。行为-影像相关分析显示，工作记忆准确性降低与扣带回区域皮层厚度减少及壳核度中心性降低相关。该研究证实巨量ANK2缺失在非人灵长类中可复现NDDs的行为、神经和分子特征，为理解巨量ANK2在灵长类大脑中的功能及NDDs的跨物种机制提供了平台，该论文发表于《Research》。

三、关键技术方法

研究人员采用了以下主要技术方法：（1）基于人工智能的三维（3D）运动识别框架，通过预校准多视角采样系统采集视频，利用深度学习模型自动标记并追踪恒河猴21个关键身体部位的3D坐标，提取46个运动学参数并进行主成分分析（PCA）和行为分类；（2）系列行为学范式，包括空间延迟反应（SDR）任务评估工作记忆、视觉辨别与反转学习（VD/RL）任务评估认知灵活性、操作性学习（OL）任务、情绪反应（ER）测试和三箱社交互动测试（SIT），并结合群体饲养条件下的行为录像分析；（3）结构磁共振成像（MRI）和静息态功能磁共振成像（rs-fMRI），分析灰质厚度、皮层面积与体积、髓鞘化（T1/T2比值）、功能连接密度、度中心性和聚类系数等网络拓扑参数；（4）液相色谱-质谱联用（LC-MS）的靶向脂质组学分析，检测脑脊液和血清中脂质种类及结构；（5）外周血转录组测序及生物信息学分析。样本队列包括KO猴4只（2只恒河猴、2只食蟹猴）和相应的WT对照，各行为学范式及影像学分析的样本量如原文所述，具体为：认知任务中KO组n=4，WT组n=9或n=13；影像学KO组n=4，WT组n=11；行为学各亚测试样本量有所变化。

四、研究结果

1. 巨量ANK2 KO猴表现出异常姿势和活动过度
利用AI三维运动识别框架，研究人员发现KO恒河猴在46个运动学参数中有43个显著高于WT猴，包括多数身体部位的运动速度和运动强度、每帧移动距离及身体高度。KO猴没有明显的位置偏好，而WT猴更多停留在特定位置。行为分类显示，KO猴在明显位移（AD）行为中的比例较高，在非位移（NAD）行为中的比例较低，具体表现为更多的左转、右转和抬头行为，以及更少的坐和左看行为。但未发现显著的刻板行为，这与婴儿期观察一致。该结果表明KO猴在新奇环境中表现出活动增加和广泛的一般行为改变。

2. 巨量ANK2 KO猴认知功能受损
在SDR任务中，4只KO猴（两种猴种）在延迟B值超过0秒时无法达到86.7%正确率的标准，在B=2秒时正确率显著低于WT猴，且能达到的最大B值也显著降低。线性混合效应模型（LMM）显示，延迟和基因型均对正确率有显著固定效应，KO组在所有5个延迟条件下均表现更差，提示工作记忆受损。在VD/RL任务中，KO猴在视觉辨别（VD）阶段的训练次数、错误数和错误率与WT猴无差异，表明联想学习正常；但在反转学习（RL）阶段，KO猴需要更多的训练次数、产生更多错误、错误率更高，且持续性错误数量约为WT猴的2倍，提示认知灵活性不足。在OL任务中，KO猴需要更多由实验者指导的人工训练次数才能达到标准，表明操作性学习能力受损。

3. 巨量ANK2 KO猴情绪调节和社交互动异常
情绪反应测试中，面对恐惧刺激（橡胶眼镜蛇），WT猴的食物取回潜伏期显著延长，接近-防御指数显著增高，而KO猴虽有潜伏期增加的趋势但未达显著，提示KO猴对恐惧刺激的情绪反应改变，未能抑制取食反应。在5个测试阶段中，WT猴对中性物体、蜘蛛和蛇的取食潜伏期随测试进行显著下降，表现出习惯化，而KO猴无此适应过程。群体饲养条件下，KO猴表现出孤僻倾向，社交等级倾向较低，总社交互动时间有降低趋势，主动理毛时间和次数显著低于WT猴，而被动理毛和社交退缩等无显著差异，表明社交缺陷主要涉及主动行为。三 chamber社交互动测试中，KO恒河猴在社交亲合阶段（阶段1）接近非社会物体（玩具猴）的时间显著多于接近陌生猴1（S1），且该非社会接近时间比WT猴显著延长；在社交记忆阶段（阶段2），KO猴对两只陌生猴的回避时间显著长于WT猴，且KO猴对同类接近和回避时间无显著差异，而WT猴对两只陌生猴的接近时间显著长于回避时间。这提示KO猴偏好非社会物体而非同类，可能解释其在群体中主动社交行为的减少。

4. 基于MRI的巨量ANK2 KO猴脑结构与功能改变
与幼年期观察一致，KO猴在4岁时仍存在持续的脑室扩大，并导致枕叶、颞叶和后顶叶的显著形态学改变。由于解剖变异，影像学分析仅限于额叶（29个区域）、前顶叶（10个区域）和6个皮层下区域。灰质厚度分析显示，KO猴在额叶多个扣带回区域（24a/b、24a/b prime、25）的GMT显著低于WT猴，而24c区域GMT显著增高。皮层表面积和灰质体积分析也显示多数差异区域在KO猴中数值降低。皮层下区域中，苍白球体积显著减小。基于T1/T2比值的髓鞘化估计显示，KO猴下丘脑和苍白球髓鞘化显著增加，其他一些区域在未校正阈值下也显示增加。静息态功能连接分析在脑叶水平显示，KO猴顶叶内半球内FC显著增加，皮层下结构与额叶之间的半球内FC显著降低；半球间FC在顶叶内增加，而在皮层下结构之间及皮层下结构与额叶之间降低。在区域水平，KO猴顶叶区域7op和5d的FCD显著增加，而额叶区域24a/b、14、10及伏隔核、壳核的FCD在未校正阈值下降低。脑网络拓扑分析显示，KO猴全局小世界参数σ显著降低，度中心性（Dc）在顶叶PEa、5d、7op及额叶8A显著增加，在壳核显著降低；节点聚类系数（NCp）在多个额叶和顶叶区域显著改变。探索性脑-行为相关分析显示，工作记忆准确性（B=2 s）与24a/b prime区域皮层厚度和壳核Dc呈正相关，提示区域性神经影像异常可能与KO猴的工作记忆损害相关。

5. 巨量ANK2 KO猴的身体和血液学参数
KO猴与WT猴在身体发育和超声心动图指标上大多无显著差异，仅主动脉瓣流速较低。血液生化检测显示KO猴总胆红素、总蛋白、球蛋白、血尿素氮和总蛋白/白蛋白比值显著降低，谷丙转氨酶和白蛋白/球蛋白比值显著升高。血液学方面，KO猴平均红细胞体积显著降低，红细胞计数有升高趋势。皮质醇和睾酮水平两组间无显著差异，但KO恒河猴T105出现异常升高的睾酮（5.35 ng/ml）和高睾酮/皮质醇比值（9.12），超出正常范围，且该猴在3岁时体型和体重均大于同龄对照。

6. 巨量ANK2 KO猴脑脊液中甘油三酯和甘油磷脂上调
脂质组学分析显示，KO猴血清中改变的脂质分子很少，而脑脊液中显示广泛变化（差异倍数>1.5或<0.67，P<0.05），几乎所有差异脂质均上调。其中磷脂酰肌醇（PI）种类变化倍数最高，但绝大多数差异脂质为甘油三酯（TG），第二大类为甘油磷脂（GP），主要为磷脂酰乙醇胺（PE）。KO猴总体TG浓度显著高于WT猴。结构分析显示，KO猴多种链长的TG浓度升高，中链长度种类增加显著；PE、PI和烷基PE（PE-O）在特定链长下也升高。不饱和TG浓度优先在中等不饱和种类中升高。膜流动性相关指标无显著组间差异，但特定低不饱和度PE/PE-O和饱和PI在KO猴中显著增加。这些结果提示巨量ANK2缺失可能破坏猴脑脂质稳态。

7. 巨量ANK2 KO猴外周血转录组免疫图谱失调
外周血转录组分析显示，KO食蟹猴有1936个基因、KO恒河猴有524个基因发生超过2倍的表达变化（|log2 fold change|>1且P<0.05）。两个猴种的基因表达模式和差异表达模式高度相关。炎症调控相关基因如TLR5、CCL2、AUZ、TARM1和CLEC4D在KO食蟹猴中下调；I型干扰素信号通路关键分子如IFI6、IFIT3、OAS1、OASL、RSAD2和MX1在KO恒河猴中显著下调。差异表达基因富集于免疫过程相关通路，特别是细胞因子产生相关通路（GO:0001819）。两个KO猴种共享的差异基因中，大部分与免疫过程相关，包括TLR5、CLEC1A、ATF3、GPR84、ENTPD1、ADGRE1、KLRC1、CXCR6和NCR1。这一结果与ASD患者外周血免疫异常及细胞因子改变的既往报道一致。

五、讨论与结论

讨论部分指出，巨量ANK2 KO猴表现出的活动过度、认知缺陷和社交互动异常与人类ANK2突变表型一致，但活动过度与携带类似AnkB-440突变的小鼠（活动减少）形成对比，提示种属特异性差异。KO猴未表现出明显的刻板行为，因此不能认为其完全复现ASD，但可能模拟NDDs的特定症状特征。重要的是，这些行为异常在婴儿期和幼年期未出现，而是在社交等级结构成熟后才显现，提示灵长类中社交行为的检测需要较长发育窗口。KO猴持续存在脑室扩大等结构异常，额叶扣带区灰质变薄可能与工作记忆和认知灵活性损害相关，而功能连接和网络拓扑的改变可能参与行为异常。脑-行为相关性分析支持区域性神经影像异常与认知表型的关联，但样本量较小，需更大队列验证。此外，KO猴未观察到癫痫或心功能障碍，但脑网络小世界系数降低与儿童失神癫痫综合征中的发现相似，仍需长期监测。讨论还提到两个极端个体的表型：T105（社交隔离、睾酮异常升高、体型偏大）和T88（矮小、体重持续偏低、血糖降低），提示巨量ANK2缺失可能导致复杂且可变异的生理结局，可能涉及敲除效率、性别依赖性反应和种属特异性因素。

研究结论总结：研究人员对巨量ANK2缺失猴进行了纵向研究，建立了这些KO猴在行为、神经影像和生理变化方面的全面生命周期时间线。与婴儿期的观察相比，这些KO猴随年龄增长出现了进行性的行为异常，包括认知、情绪和社交缺陷。它们还表现出脑结构和功能的改变，以及脂质组学和免疫相关转录组谱的失调。这些发现表明，非人灵长类中巨量ANK2缺失复现了人类NDDs的关键表型特征，为脑功能发育和疾病发病机制的不同维度提供了跨物种见解，从而有助于未来的机制和治疗研究。