《Cell Reports》：Complementation of a human disease phenotype by intercellular mRNA transfer
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越来越多的证据表明，mRNA通过称为隧道纳米管（tunneling nanotubes, TNTs）的细胞质连接进行细胞间转移，但转移后的mRNA是否被翻译并在转移后引起细胞变化尚不清楚。研究人员利用多重证据表明，转移的mRNA经历翻译，并能在体外互补基因
越来越多的证据表明，mRNA通过称为隧道纳米管（tunneling nanotubes, TNTs）的细胞质连接进行细胞间转移，但转移后的mRNA是否被翻译并在转移后引起细胞变化尚不清楚。研究人员利用多重证据表明，转移的mRNA经历翻译，并能在体外互补基因突变的表型。例如，人类过氧化物酶体生物发生障碍——Zellweger综合征（Zellweger Syndrome）——由PEX5和PEX6等基因的突变引起。研究人员证明，患者来源的PEX6突变成纤维细胞或PEX5敲除细胞与野生型细胞共培养可导致过氧化物酶体的从头生物发生（de novo peroxisome biogenesis）。研究人员还提供了通过转移编码HSF1转录因子或CRE重组酶的mRNA实现基因互补的其他实例。互补作用通过TNT介导的mRNA转移及受体细胞内的翻译实现，而非通过外泌体（exosomes），也非通过蛋白质或过氧化物酶体转移。该研究为mRNA转移的生理学意义提供了证据，并提示了mRNA治疗的另一种途径。
## 论文解读文章
### 研究背景与科学问题
信使RNA（messenger RNA, mRNA）已被证实是多种生物学背景下细胞间通讯的新型介质，包括组织发育、病毒感染传播、肿瘤细胞转移、氧化应激调控及免疫细胞成熟等。此前研究普遍认为mRNA通过分泌性实体如细胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs）或外泌体进行运输，但关于这些囊泡所携带mRNA是否完整、能否在受体细胞中翻译并改变细胞生理功能，证据十分有限。相比之下，隧道纳米管（tunneling nanotubes, TNTs）是一种直接连接细胞的细长肌动蛋白丝状细胞质通道，可转移细胞器、囊泡、蛋白质等多种货物。尽管RNA-seq及单分子荧光原位杂交（smFISH）已证实mRNA可经TNT转移，但转移后的mRNA是否被翻译、是否对受体细胞产生功能性影响，仍是悬而未决的核心问题。基于此，研究人员系统探究了细胞间mRNA转移能否在体外互补遗传突变表型。
### 研究内容与意义
该研究发表于《Cell Reports》，通过四种独立的受体细胞模型证实：供体细胞中具有完整功能的mRNA可通过TNT转移至突变受体细胞，并在受体细胞中被翻译为功能蛋白，从而互补由基因缺陷引起的突变表型。研究涉及Zellweger综合征（ZS，一种过氧化物酶体生物发生障碍）、热休克因子1（HSF1）缺失及CRE重组酶报告系统等模型。该工作首次提供了转移mRNA在受体细胞中原位翻译的直接证据，确立了mRNA转移的生理学意义，并提示了基于mRNA转移的基因治疗新策略。
### 主要关键技术方法
研究人员主要采用了以下技术手段：（1）单分子荧光原位杂交（single-molecule fluorescence in situ hybridization, smFISH），用于检测和定量转移mRNA；（2）smFISH与免疫荧光联用（FISH-IF），用于检测转移mRNA与其翻译蛋白的空间共定位；（3）嘌呤霉素邻近连接分析（puromycin proximity ligation assay, Puro-PLA），用于原位检测新合成的多肽；（4）共培养、Transwell分隔培养及条件培养基处理，用于区分接触依赖性与非接触依赖性转移；（5）外泌体分离与RT-PCR分析。样本包括Zellweger综合征患者来源的SV40转化皮肤成纤维细胞（PEX6突变）、HEK293T细胞、HSF1敲除小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）、Ai9报告基因小鼠MEF及多种免疫细胞系。
### 研究结果
**HSF1 mRNA转移至HSF1?/?细胞并实现热休克互补：** 研究人员将HSF1?/? MEF与过表达人HSF1-GFP的供体细胞共培养48小时，通过smFISH检测到HSF1-GFP mRNA转移至受体细胞，部分恢复了热休克诱导的HSP70转录，但改善程度较温和，难以检测到细胞存活等生理效应。
**野生型细胞共培养互补Zellweger综合征细胞来源的过氧化物酶体缺陷：** 将稳定表达GFP-SKL（含过氧化物酶体靶向信号1型）的HEK293T供体细胞与表达RFP-SKL的PEX6突变患者细胞共培养6天后，约半数受体细胞出现红色点状过氧化物酶体，表明发生了过氧化物酶体的从头生物发生。未检测到绿色或黄色过氧化物酶体，排除了完整细胞器转移的可能。Transwell分隔及条件培养基实验中互补效率降低约10倍，证明该过程依赖直接细胞接触。
**共培养中PEX6 mRNA的转移：** 研究人员构建了PEX6-Tomato融合报告基因并建立稳定表达供体细胞系。smFISH检测显示，共培养2天后受体细胞中检测到约40拷贝/细胞的PEX6-Tomato mRNA，4天后增至约250拷贝/细胞，且该转移严格依赖细胞间直接接触。
**转移的PEX6 mRNA在受体细胞中发生翻译：** 通过在PEX6 CDS的5′端插入7xHA标签，研究人员利用FISH-IF检测到HA蛋白信号与Tomato mRNA信号在空间上相邻（距离约300-400nm），约10%的转移mRNA与HA斑点相邻。进一步采用Puro-PLA实验，在共培养后的受体细胞中检测到平均45个PLA斑点/细胞，直接证明转移的PEX6-Tomato mRNA在受体细胞中经历了新生翻译。
**细胞间mRNA转移可互补其他过氧化物酶体生物发生缺陷：** 将表达RFP-SKL的PEX5敲除（PEX5?/?）细胞与表达GFP-SKL的野生型细胞共培养6天，过氧化物酶体阳性细胞数量增加约2.5倍。
**CRE重组酶mRNA转移激活受体细胞基因表达：** 利用Ai9报告系统（含LoxP-STOP-LoxP-tdTomato基因座），表达CRE重组酶mRNA的HEK293T或多种小鼠细胞系作为供体共培养72小时后，约1-3%的Ai9受体细胞变为tdTomato阳性。当CRE mRNA上带有MS2茎环结构并与tdMCP-GFP共表达时，mRNA转移和tdTomato激活均降低，表明效应源于mRNA而非Cre蛋白。CAD细胞效率最高，与其形成更多TNT相关。
**TNT形成与表型变化相关：** 过表达TNT正调控因子EPS8增加了CAD细胞与Ai9细胞间的TNT数量并提高互补效率。利用生长素诱导降解系统（AID）降解供体细胞中的CRE蛋白后，受体细胞表型变化不受影响，排除了蛋白质转移的贡献。分离的外泌体不含可检测的CRE蛋白和完整性mRNA，添加外泌体也不能诱导Ai9细胞表型变化，排除了外泌体介导的可能。
**原代细胞中的互补作用：** 原代Ai9 MEF与五种供体细胞系共培养均出现tdTomato阳性细胞，其效率较永生化细胞低，并与TNT形成数量相关。
### 讨论与结论
研究人员提出细胞间mRNA交换（intercellular mRNA exchange, ImAx）模型：野生型mRNA经TNT从供体细胞转移至突变受体细胞后，在受体细胞中经翻译产生功能蛋白，从而直接改变细胞生理状态。该研究排除了外泌体、蛋白质转移和完整过氧化物酶体转移的贡献。研究人员指出，过氧化物酶体"鬼影"（ghost）结构的存在可能是PEX6突变细胞被成功互补的原因，而缺乏早期过氧化物酶体生物发生因子的细胞（如PEX19?/?）则难以通过mRNA转移互补。研究还讨论了同种异体造血干细胞移植（HSCT）治疗遗传病的潜在应用，以及现有局限性——所有实验均在二维培养体系中进行，TNT介导的mRNA转移在体内致密组织中的效率及机制仍有待阐明。结论为：TNT介导的mRNA转移对受体细胞具有重要的生理学影响，可作为基因治疗的另一种新途径。
