野生远志（Polygala crotalarioides）内生真菌：多样性、抗氧化能力及乙酰胆碱酯酶抑制潜力

《Journal of Fungi》：Endophytic Fungi from Wild Polygala crotalarioides: Diversity, Antioxidant Capacity and Acetylcholinesterase Inhibitory Potential

　　

野生远志（Polygala crotalarioides）是一种传统用于神经健康保护的民族药用植物。与药用植物相关的内生真菌正日益被视为生物活性天然产物的来源；然而，野生P. crotalarioides中其多样性与生物活性仍知之甚少。研究人员采用高通量测序（high-throughput sequencing, HTS）与依赖培养的方法，探究野生P. crotalarioides内生真菌的多样性、群落组成与生物活性。可培养分离株通过ITS测序鉴定，并进一步筛选乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase, AChE）抑制与抗氧化活性。结果表明，共检测到818个真菌操作分类单元（operational taxonomic units, OTUs），呈现显著的组织特异性群落分化。茎组织拥有最高的真菌多样性、丰富度与最多独特OTUs。子囊菌门（Ascomycota）与担子菌门（Basidiomycota）在各组织中占优势，不同器官富集不同标志分类群。功能注释显示营养型组成存在显著组织依赖性。108株可培养分离株中，青霉属（Penicillium）sp. PRP024与木霉属（Trichoderma）sp. PRP008表现最强AChE抑制活性（>80%），而镰刀菌属（Fusarium）sp. PSP053、间座壳属（Diaporthe）sp. PSM027与凸脐蠕孢属（Exserohilum）sp. PSP042具显著抗氧化活性。野生P. crotalarioides承载高度多样且组织特异的内生真菌群落，若干分离株具前景的AChE抑制与抗氧化活性，凸显药用植物相关内生真菌作为抗氧化天然产物的潜在来源。

研究背景方面，远志属（Polygala）含约500种，中国分布超39种，具神经保护、抗氧化、改善记忆与抗炎等用途；其活性成分包括三萜皂苷、呫吨酮、寡糖酯、黄酮与香豆素等。阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）进程中氧化应激与胆碱能障碍关键，乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase, AChE）为重要治疗靶点，现有多奈哌齐、利凡斯的明、加兰他敏等天然AChE抑制剂常伴胃肠、心血管与神经不良反应。P. crotalarioides为中国西南特有多年生草本，既往研究仅限栽培技术与初步植物化学分析，野生植株不同组织与生长阶段内生真菌的群落组成、组织分布及时间变异完全未探明。因此研究人员整合培养非依赖HTS与培养依赖分离，以揭示野生P. crotalarioides叶、茎、根、花内生真菌资源及其AChE抑制与抗氧化潜力。

主要关键技术方法如下：样本于2022年5月采自云南沧源上寨自然村，设3个3×3米样方（间距≥150米），每样方随机选5株健康植株，按根、茎、叶、花分器官混为3个生物学重复；表面消毒后一部分直接用于HTS，一部分用于分离。HTS以ITS1F/ITS2R扩增真菌ITS区，Illumina NextSeq 2000测序，UPARSE按97%相似度聚OTU，UNITE数据库注释，做α/β多样性、LEfSe标志分类群与FUNGuild营养型注释。培养依赖法将表面灭菌组织接PDA获108株，ITS1/ITS4测序比对GenBank定种属；选代表株以大米固态发酵（solid-state fermentation）制备粗提物，用改良Ellman比色法测AChE抑制、DPPH与ABTS自由基清除并算IC₅₀。

研究结果部分保留小标题说明。3.1 真菌ITS基因测序数据：过滤后得538,528条高质量序列，抽平至每样本31,294条，聚出818个非冗余OTU，Good’s覆盖>99%，说明测序充分捕获野生P. crotalarioides内生真菌群落。3.2 不同组织真菌群落α多样性：茎的Shannon最高、Simpson最低，ACE与Chao1最大，多样性与丰富度最高，叶最低，花中等，根居中；证明组织间α多样性显著分化。3.3 群落组成：818 OTU归9门31纲80目180科288属；Ascomycota与Basidiomycota跨组织占优，叶中Cercospora绝对优势，根以Talaromyces、Exophiala、Papiliotrema、Fusarium为主，茎含Cercospora与Papiliotrema，花以Apiotrichum与Cercospora为主；根自成一支、叶茎花较相似。3.4 β多样性：PCoA与层次聚类显示四组织完全分离，ANOSIM中R=0.79938、p=0.001，证实组织特异性群落结构。3.5 差异富集分类群：LEfSe示根富Eurotiomycetes、Thanatephorus等，茎富Diaporthales、Diaporthe、Cyphellophora等，叶富Ascomycota、Dothideomycetes、Cercospora等，花无显著标志类群。3.6 FUNGuild营养型：叶以丛枝菌根真菌为主，根以未定义腐生与动物病原为主，花多未分类与土壤腐生，茎营养型最多样且分布匀。3.7 可培养真菌分离鉴定：获108株归2门4纲9目14科17属，Colletotrichum与Fusarium跨三组织高频；叶、根、茎分别有5、6、2个特有属，四属Colletotrichum、Diaporthe、Fusarium、Penicillium三者共有。3.8 生物活性筛选：3.8.1 AChE抑制中Penicillium sp. PRP024（83.87%）与Trichoderma sp. PRP008（82.53%）>80%，Cercospora sp. PLM021的IC₅₀最低418.1 μg/mL，阳性加兰他敏67.5 μg/mL；3.8.2 DPPH清除中Fusarium sp. PSP053最强98.03%，Exserohilum sp. PSP042 IC₅₀ 258.7 μg/mL最低，维C 10.10 μg/mL；3.8.3 ABTS清除中Diaporthe sp. PSM027最高95.52%，Fusarium sp. PSP053 IC₅₀ 418.7 μg/mL最低，维C 70.06 μg/mL。

讨论部分总结：研究人员指出野生宿主内生真菌相较栽培P. crotalarioides群落与活性谱不同；茎高多样性或因营养运输与碳微生境，叶受紫外与衰老过滤，花防御代谢、根受土微竞争限制，但均为假设需验证。Ascomycota广布与组织生理微生境选择压一致。108株远少于818 OTU，因标准培养基难复刻体内代谢、氧梯度等培养偏见。相较前期栽培P. crotalarioides用液体PDB仅55株、P. sibirica仅23株，本研究野生株108株且大米固态发酵次生代谢更丰富，部分菌株AChE抑制>80%；但野生与栽培活性差也受发酵模式影响。局限为单点采样、仅体外粗提，需多点海拔气候采样及细胞/体内验证。

结论部分翻译：综上，野生远志（Polygala crotalarioides）承载多样且组织特异的内生真菌群落，茎为真菌多样性主要储库。若干真菌分离株展现前景良好的乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase, AChE）抑制与抗氧化活性，表明这些菌株可作为初步生物活性筛选候选以指导活性代谢物的进一步化学表征。结果拓展了对该药用植物植物—真菌关联的认识，并为从其内生真菌资源中发现生物活性天然产物奠定基础。论文发表于《Journal of Fungi》。