《Journal of Oral Microbiology》：Fusobacterium bacteriophage FNU1 disrupts complex periodontal pathogenic biofilms comprising Fusobacterium polymorphum, Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia and Prevotella intermedia
摘要
背景：牙周炎是一种慢性炎症性疾病，影响全球超过50%的人口，导致不可逆的牙龈损伤、牙槽骨吸收并最终造成牙齿脱落。牙周炎源于稳定的多菌种生物膜，其致病性由持续的抗菌干扰下出现的生态学互作所驱动。梭杆菌属（Fusobacterium spp.）被认为是提供该生态位支架的关键微生物组分，该生态位包含福赛坦氏菌（Tannerella forsythia）、中间普氏菌（Prevotella intermedia）和牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis）等致病共生菌（pathobionts）。
目的：探讨口腔微生物互作如何塑造牙周生物膜，以及通过噬菌体选择性靶向多形梭杆菌（Fusobacterium polymorphum）能否瓦解这一致病群落结构。
材料与方法：采用体外生物膜模型，分别建立：(i) 多形梭杆菌、福赛坦氏菌和中间普氏菌的单菌种生物膜；(ii) 多形梭杆菌分别与福赛坦氏菌、中间普氏菌组成的双菌种生物膜；(iii) 包含多形梭杆菌、福赛坦氏菌、中间普氏菌和牙龈卟啉单胞菌的四菌种复杂生物膜。随后将生物膜暴露于多形梭杆菌特异性噬菌体FNU1，以评估靶向病毒捕食对生物膜群落中单一成员所产生的生态学影响。采用CellTrace?增殖分析法和活死染色，通过共聚焦激光扫描显微镜观察生物膜形成、空间组织和微生物互作。使用0.1%结晶紫染色对群落生物膜生物量进行定量。
结果：与较简单的群落相比，多菌种生物膜表现出增强的生物量和更高的细胞密度。噬菌体FNU1对多形梭杆菌的瓦解作用导致单菌种多形梭杆菌生物膜以及双菌种和四菌种复杂生物膜的总生物量显著降低，并改变细胞密度。
结论：研究结果支持多形梭杆菌特异性噬菌体在瓦解牙周致病共生菌复杂生物膜中的作用。研究强调了多形梭杆菌在微生物生物膜群落动态中的重要性，对其精确靶向所引起的生态扰动具有逆转牙周炎慢性炎症中菌群失调的潜力。
关键信息：含多形梭杆菌与牙周致病共生菌的双菌种生物膜表现出生物量的协同增加。四菌种多种微生物生物膜表现出显著高于单菌种和双菌种生物膜的细胞密度和生物量。利用噬菌体FNU1对支架物种多形梭杆菌的靶向瓦解使四菌种生物膜生物量减少超过90%，凸显了精确噬菌体靶向在瓦解失调的牙周生物膜方面的潜力。
关键词：噬菌体疗法|多菌种互作|厌氧致病共生菌|口腔菌群失调|微生物群调节
牙周致病菌互作与噬菌体靶向干预研究解读
**研究背景与科学问题**
牙周炎作为全球最常见的慢性炎症性疾病之一，影响超过50%的人口，其病理特征表现为不可逆的牙龈组织损伤、牙槽骨吸收和最终牙齿丧失。牙周炎的发病机制根植于龈下菌斑中形成的稳定多菌种生物膜，这些生物膜的致病性由持续的微生物群落内生态学互作所驱动，并表现出对抗菌干预的显著耐受性。尽管口腔卫生保健领域数十年来持续进步，但自1990年以来，严重牙周炎的年龄标准化全球患病率始终维持在约12%的水平，提示现行防治策略存在根本性局限。
人源口腔微生物组是一个包含众多细菌物种的复杂生态系统，在共生维持和口腔健康中发挥关键作用。当该微生物群落受到免疫失调和不良口腔卫生习惯等因素干扰时，将导致菌群失调，促进特定口腔致病共生菌的过度增殖。这种失调状态促使龈下生物膜的形成，病原菌在其中持续分泌毒力因子，推动牙周炎的病理进程。值得注意的是，牙周炎不仅局限于口腔局部病理改变，还系统性地关联着阿尔茨海默病、糖尿病、心血管疾病、不良妊娠结局以及远处原发性和转移性癌症等严重疾病风险的升高。
在牙周生物膜中，细菌物种间通过释放蛋白质、酶类和其他信号因子实现互作，增强邻近致病物种的生长、营养可利用性和群落稳定性。生物膜的一个关键后果是为其中的细菌提供对抗菌药物的保护和耐受性，抗生素难以穿透这些复杂结构，限制了其在靶向牙周病原体方面的有效性。因此，目前尚无特异性针对牙周炎微生物病因的治疗手段。
具核梭杆菌广义种（Fusobacterium nucleatum sensu lato）作为牙周生物膜结构中的重要成员，在健康个体龈下菌斑中丰度较低，但在牙周炎患者的龈下菌斑中高度富集。该类细菌被称为口腔生物膜中的”桥接菌”，通过产生黏附分子和外膜蛋白促进其他致病共生菌的附着和生长，介导三维群落中物种间的相互作用。牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis）、中间普氏菌（Prevotella intermedia）和福赛坦氏菌（Tannerella forsythia）等口腔病原体能够与具核梭杆菌广义种黏附并共聚集，从而促进牙周生物膜的成熟。基于这一结构特性，研究人员提出假说：靶向作为支架的梭杆菌可能导致依赖性致病共生菌的群落崩溃。
噬菌体作为特异性感染细菌的病毒，为控制细菌感染提供了天然且可持续的途径。与传统抗生素不同，噬菌体能够精确靶向其特定宿主细菌，对微生物组中其他细菌的影响极小，且凭借其产生的多糖解聚酶能够穿透生物膜。近期针对噬菌体疗法的临床试验荟萃分析已在多种动物模型和人类患者中证实了其治疗各类细菌感染的有效性和安全性。尽管已有体外和体内研究证明噬菌体能够分解细菌生物膜，但针对口腔内牙周生物膜靶向的研究仍十分有限，且尚无研究探讨靶向单一物种能否导致动态多菌种牙周生物膜的崩溃。
基于上述背景，本研究旨在探讨以多形梭杆菌（Fusobacterium polymorphum）特异性噬菌体FNU1靶向该支架物种，体外瓦解由多形梭杆菌、牙龈卟啉单胞菌、中间普氏菌和福赛坦氏菌构成的多菌种牙周致病生物膜的效能。
**主要技术方法概述**
本研究采用多种关键技术方法：使用美国典型培养物保藏中心（American Type Culture Collection, ATCC）来源的四种细菌菌株建立单菌种、双菌种和四菌种体外生物膜模型；利用0.1%结晶紫染色法在600 nm波长处定量分析生物膜生物量；采用CellTrace?细胞增殖检测体系结合共聚焦激光扫描显微镜（Confocal Laser Scanning Microscopy, CLSM）对生物膜中不同细菌物种进行差异荧光标记和三维空间组织可视化；运用SYBR? Gold和碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）活死染色评估生物膜内细菌细胞活力；通过ImageJ软件的3D Object counter v2.0进行图像分析和细菌增殖定量；使用R/R studio v 2026.01中的ggplot2包完成统计分析与数据可视化。噬菌体FNU1以1×10
11 PFU mL
?1滴度应用于各生物膜处理组。
**研究结果**
*Periodontal pathobionts form synergistic multi-species biofilms（牙周致病共生菌形成协同性多菌种生物膜）*
该部分研究结果显示，中间普氏菌和福赛坦氏菌分别与多形梭杆菌共培养形成的双菌种生物膜表现出协同性生长增强。与单菌种中间普氏菌和福赛坦氏菌生物膜相比，含多形梭杆菌的双菌种生物膜生物量分别增加200%（OD
600从0.5升至1.5）和229%（OD
600从0.14升至0.46）。当四种口腔致病共生菌（多形梭杆菌、牙龈卟啉单胞菌、中间普氏菌和福赛坦氏菌）共同培养形成复杂生物膜时，其生物量比多形梭杆菌/中间普氏菌双菌种生物膜显著增加68%（OD
600从1.5升至2.52），比比多形梭杆菌/福赛坦氏菌双菌种生物膜增加400%（OD
600从0.46升至2.52）。经噬菌体FNU1处理后，所有生物膜的生物量均显著降低（p值<0.001）：多形梭杆菌单菌种生物量减少50%；与中间普氏菌的双菌种生物膜生物量减少15%（OD
600从1.5降至1.27）；与福赛坦氏菌的双菌种生物膜减少41.3%（OD
600从0.46降至0.27）；四菌种复杂生物膜减少60%（均p值<0.001）。
*Tracking proliferation of periodontal pathobionts in multi-species biofilms（追踪多菌种生物膜中牙周致病共生菌的增殖）*
通过差异荧光标记追踪各菌种增殖情况。在双菌种生物膜中，多形梭杆菌与福赛坦氏菌和中间普氏菌共培养时分别占50,176（46,670–58,043）cells/mm2和143,752（119,523–143,922）cells/mm2。在四菌种复杂生物膜中，各菌种增殖较双菌种生物膜普遍增加：中间普氏菌从双菌种生物膜中的63,888（56,763–69,340）cells/mm2增加至复杂生物膜中的223,282（193,137–226,106）cells/mm2（约4倍）；福赛坦氏菌从9,376（7,948–12,088）cells/mm2增至135,060（115,653–144,250）cells/mm2（超过14倍）；牙龈卟啉单胞菌与既往报道相比，从62,692（58,394–66,726）cells/mm2增至229,914（207,668–421,687）cells/mm2（约4倍）。
*Effect of bacteriophage FNU1 treatment on bacteria proliferation and biofilm density（噬菌体FNU1处理对细菌增殖和生物膜密度的影响）*
噬菌体FNU1处理引起双菌种和四菌种复杂生物膜中的细菌密度显著降低，不仅影响宿主多形梭杆菌，还涉及非宿主的牙龈卟啉单胞菌、中间普氏菌和福赛坦氏菌。在多形梭杆菌/中间普氏菌双菌种生物膜中，FNU1处理使总细胞密度减少约83.4%（173,131/207,640 cells/mm2）；在多形梭杆菌/福赛坦氏菌双菌种生物膜中，总破坏能力为76.3%（45,424/59,552 cells/mm2）。在更复杂的四菌种生物膜中，单次应用噬菌体FNU1使总细胞密度降低高达94.2%（1,326,955/1,408,005 cells/mm2）。其中多形梭杆菌减少97.5%（798,901 cells/mm2），牙龈卟啉单胞菌减少85.3%（196,144/229,914 cells/mm2），中间普氏菌减少93.2%（208,185/223,282 cells/mm2），福赛坦氏菌减少91.6%（123,725/135,060 cells/mm2）。
*Impact of bacteriophage FNU1 on viability and density of the four-species complex biofilm（噬菌体FNU1对四菌种复杂生物膜活力和密度的影响）*
对四菌种复杂生物膜经噬菌体处理后残余细菌的活力评估显示，未经处理的生物膜中约77%（1,586,611/2,069,483 cells/mm2）为膜完整（活菌）细菌，23%（482,872/2,069,483 cells/mm2）为膜受损（死菌）。经FNU1处理后，生物膜形成细胞仅剩约6%，其中大多数（约82%，571,873/697,986 cells/mm2）为膜受损细胞，仅有18%（129,113/697,986 cells/mm2）为膜完整活菌。
**讨论与结论**
本研究证实了多形梭杆菌在牙周生物膜中的结构性支架角色，并证明利用其特异性噬菌体FNU1进行选择性靶向可显著瓦解包含四种不同致病菌种的复杂群落。研究结果凸显了靶向单一关键物种引发复杂致病生物膜崩溃的独特潜力。在临床牙周炎龈下菌斑样本中，梭杆菌属相对丰度为6-8%，而丰度次之的卟啉单胞菌属和普雷沃氏菌属分别为2%和4%。本研究追踪结果显示支架菌多形梭杆菌的丰度至少是丰度第二的牙龈卟啉单胞菌的三倍。其他研究组也报道了牙周炎患者中具核梭杆菌广义种相对丰度降低者对标准牙周治疗的应答更佳，表明纠正牙周生物膜菌群失调是该慢性炎症性疾病标准治疗的重要辅助手段。本研究的体外实验表明，单次应用噬菌体FNU1使双菌种生物膜减少至少70%、四菌种复杂生物膜减少94%的生物膜量和细菌活力，显示了其消除牙周菌斑生物膜中致病共生菌和菌群失调的潜力。这项工作的重要性还在于，不同于将噬菌体应用于单一外源性致病菌引起的明确感染性疾病，研究人员证明了噬菌体疗法在由内源性细菌群落菌群失调引起的慢性疾病中的潜在有效性。这一发现的影响可能超越慢性牙周炎，对由复杂多菌种生物膜引起的其他难治性疾病具有转化意义。
**研究结论**
总之，本研究强化了多形梭杆菌在牙周生物膜中的重要结构作用，并证明通过噬菌体FNU1对其进行选择性靶向可显著瓦解由四种不同致病菌种组成的复杂群落。这一发现具有新颖性和独特性，它说明利用噬菌体靶向单一关键细菌物种——多形梭杆菌——即可导致复杂致病生物膜的崩溃。就此类工作的转化前景而言，多形梭杆菌特异性噬菌体有望通过其瓦解复杂生物膜和纠正慢性牙周炎症中菌群失调的能力，作为口腔微生物组的调节剂应用。本研究的成果也为治疗由复杂多菌种生物膜引起的其他疾病提供了启示。
