HPV+头颈癌中瘤内和系统性B细胞应答对HPV E蛋白的广泛靶向

《OncoImmunology》：Broad targeting of HPV E proteins by intratumoral and systemic B cell responses in HPV+?head and neck cancer

　　

B细胞可占肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）的相当比例，并与多种恶性肿瘤的较好预后相关。然而，其抗原特异性——这一赋予其特定功能的关键因素——在很大程度上仍属未知。本研究表明，在人乳头瘤病毒阳性头颈癌（HPV⁺ HNC）患者的肿瘤中，相当比例的瘤内抗体分泌细胞（ASCs）对HPV E蛋白具有特异性。研究人员利用IgG酶联免疫斑点分析（ELISpot）对肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）进行检测，发现在几乎所有患者中均可检测到HPV E蛋白特异性ASCs，其可占全部瘤内IgG⁺ ASCs的近三分之一。针对病毒蛋白E1和E2的ASC反应持续多于针对经典癌蛋白E6和E7的反应。HPV特异性瘤内ASCs在原发肿瘤与转移淋巴结之间以及血浆IgG滴度之间均呈强相关，表明瘤内肿瘤特异性ASCs至少部分地贡献于系统性抗肿瘤应答。为进一步解析肿瘤特异性抗体应答的组成，研究人员开发了一种新型多重抗原流式免疫分析（MAFIA），能够同时且标准化地定量所有主要免疫球蛋白类别和IgG亚类中的HPV E特异性抗体。将MAFIA应用于HPV⁺ HNC患者血浆样本，结果显示HPV特异性血浆抗体主要由IgG1、IgG3和IgA组成，其中针对E1和E2的中位反应最高。总体而言，本研究描绘了HPV⁺ HNC中HPV特异性体液应答在瘤内和系统水平上的抗原层级与组成，为未来生物标志物及下一代治疗策略的开发提供了框架。

**HPV阳性头颈癌中HPV E蛋白特异性体液免疫的广度、层级与组成**

HPV阳性头颈癌（HPV⁺ HNC），尤其是口咽鳞状细胞癌，是一种病毒驱动的恶性肿瘤，目前在美国每年新增15,000–18,000例，预计到2030年将升至每年30,000例。病毒癌蛋白E6和E7分别通过靶向降解p53和失活视网膜母细胞瘤蛋白（pRb）驱动恶性转化，其持续表达使HPV驱动的肿瘤在免疫学上区别于由宿主基因致癌突变所致的HPV阴性肿瘤。虽然基因组整合通常将病毒基因表达限制于E6和E7，但大多数HPV⁺ HNC中存在游离型病毒基因组拷贝，从而允许额外表达游离型状态依赖的早期蛋白E1、E2、E4和E5，这大幅扩展了可供免疫识别和攻击的肿瘤相关抗原库。然而，免疫系统究竟主要靶向哪些HPV蛋白——尤其是在肿瘤微环境（TME）内——此前尚未得到详细阐明。当前仅靶向E6和E7的免疫治疗策略（包括治疗性疫苗和T细胞受体基因治疗）临床疗效有限，亟需全面定义TME中HPV特异性免疫应答的抗原广度与组成，以指导下一代干预策略的理性设计。

研究人员从美国俄亥俄州立大学综合癌症中心招募了两组经循环肿瘤DNA和原位杂交确认为HPV阳性的HNC患者。队列1共31例，其中29例为未经治疗、2例为复发患者，用于瘤内分析和酶联免疫吸附测定（ELISA）及MAFIA验证；队列2为扩展MAFIA队列，共50例。为全面解析HPV特异性体液免疫，研究人员采用了三种关键技术手段。第一，利用IgG酶联免疫斑点分析（ELISpot）对从原发肿瘤和转移淋巴结（metLN）分离的肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）进行检测，直接定量各HPV E蛋白特异性的IgG⁺抗体分泌细胞（ASCs）。第二，采用ELISA检测血浆中针对HPV E蛋白的IgG、IgA和IgM滴度。第三，自主开发并验证了一种新型多重抗原流式免疫分析（MAFIA），将重组HPV16 E蛋白和对照抗原加载到光谱编码荧光珠上，利用HPV16 E2特异性人单克隆抗体（hmAb）的免疫球蛋白类别和IgG亚类变体作为标准品，实现单一反应中对IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgM六种抗体类别的同步标准化定量。

研究结果显示，瘤内B细胞广泛识别HPV E蛋白。IgG分泌细胞占TILs的0.02%–4.8%，平均约0.5%。在ELISpot分析中，绝大多数患者对多数HPV E蛋白均表现出ASC反应，HPV反应性占瘤内IgG⁺ ASCs的比例最高可达29%；30例患者中仅1例完全缺乏可检测的瘤内HPV特异性ASC反应。E1、E2、E4、E6和E7在原发肿瘤中的靶向率分别为58%（14/24）、75%（18/24）、50%（12/24）、67%（16/24）和54%（13/24）。E1和E2是两个最优势的抗原，E4反应最弱。流感反应性旁观者ASCs仅约50%的肿瘤中可检出且量级较低。原发肿瘤与匹配metLN中的HPV特异性ASC反应呈强相关。值得注意的是，针对目前未纳入免疫治疗策略的E1、E2和E4的累积ASC反应显著高于经典癌蛋白E6和E7，平均约高出2倍。

系统性体液反应同样广泛靶向HPV E蛋白并与瘤内ASC反应相关联。血浆中针对大多数HPV E蛋白的IgG抗体可检出，E4特异性IgG仅在约50%样本中可检出且反应最弱。IgA和IgM反应较低或不可检测。循环HPV特异性IgG滴度与瘤内HPV特异性IgG⁺ ASC数量强相关，而流感反应性旁观者ASCs与其血浆IgG滴度之间无此相关性。在IgG、IgA和IgM三种类别中，针对E1+E2+E4的累积抗体滴度均显著高于E6+E7。

MAFIA平台的开发与验证方面，针对六种抗体类别生成的hmAb标准曲线拟合优度极佳，R²值介于0.9919–0.9970之间，检测限（LOD）范围为151 pg/mL（IgG3）至579 pg/mL（IgG1），实现了亚纳克级灵敏度。在24例患者血浆中，MAFIA定量的IgG1、IgG3、IgA和IgM抗体浓度与ELISA终点滴度强相关，Pearson R²分别为0.9085、0.9097、0.9902和0.8313（均P<0.0001），验证了该平台的定量准确性。应用于50例患者的扩展队列后，MAFIA揭示了血浆HPV特异性抗体以IgG1和IgA为主导。最高中位IgG1浓度针对E1和E2，且与流感H1血凝素（HA）特异性滴度相当或更高；IgG2反应主要靶向E2；IgG3主要针对E1；IgG4在五个抗原中普遍稀疏；IgA模式与IgG1类似，在部分患者中对E4和E6存在显著个体反应；IgM仅在部分患者中针对E1和E2可检出。

在讨论部分，研究人员提出E1和E2免疫优势的可能机制：多数HPV⁺ HNC肿瘤中病毒基因组以游离型形式维持，允许表达完整早期基因库；E1和E2是最大的HPV早期蛋白，提供更多B细胞表位；尽管E6和E7在RNA水平更高，但其翻译和稳定性差异可能使E1和E2蛋白水平更高、抗原丰度更大。瘤内ASC与血浆抗体滴度的强相关性支持肿瘤本身作为活动性B细胞反应部位、并部分贡献于系统性体液免疫的模型。MAFIA的标准化定量能力还实现了跨研究和跨实验室的直接比较。

研究结论部分可翻译为：综上所述，本研究的发现和所开发工具对生物标志物应用和治疗性疫苗设计均具有潜在意义。在生物标志物方面，瘤内HPV特异性ASCs与血浆抗体滴度之间的强相关性提示，循环HPV特异性抗体——尤其是针对E1和E2者——可能作为瘤内免疫状态的可靠替代指标；未来应评估在E6和E7基础上加入E1和E2能否进一步提高血清学筛查的灵敏度。在治疗性疫苗开发方面，本研究数据支持进一步探索将E1和E2抗原纳入治疗性疫苗，以增强内源性抗肿瘤免疫应答的广度和强度，最终有望改善当前仅靶向E6和E7的疫苗所表现出的有限临床疗效。该研究发表在《OncoImmunology》。