《Viruses》：Elicitation of Potent H5N1- and H7N9-Neutralizing Antibody Responses in Rhesus Macaques by Sequential Heterologous Vaccination with mRNA and Adenoviral Vectors Encoding Full-Length Hemagglutinins
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在持续进行的 H5N1 泛动物流行（panzootic）背景下，高致病性禽流感（Highly Pathogenic Avian Influenza，HPAI）具有巨大大流行风险。HPAI 以家禽高致死率为特征，包含甲型流感病毒（Influenza A Viru
在持续进行的 H5N1 泛动物流行（panzootic）背景下，高致病性禽流感（Highly Pathogenic Avian Influenza，HPAI）具有巨大大流行风险。HPAI 以家禽高致死率为特征，包含甲型流感病毒（Influenza A Virus，IAV）H5N1 与 H7N9 亚型，人类感染病死率达 40–50%。为促进有效 HPAI 疫苗接种方案开发及用于预防与治疗的中和单克隆抗体（neutralizing monoclonal antibodies，nmAbs）筛选，研究人员开展概念验证试点研究：构建一系列编码 HPAI HA 的 mRNA 与腺病毒载体疫苗，并在 IAV 初始阴性（IAV-na?ve）印度恒河猴（Rhesus Macaques，RMs）中评估免疫原性。所有 RMs 均产生可识别两种 HPAI HA 的结合 IgG；接种全长 HA 的 RMs 可检出 HPAI 中和抗体（nAbs），而仅接种 HA 茎部（stem）者未检出。两只动物血清对 H5N1 的 ID50 滴度约 1:100,000，对 H7N9 约 1:50,000。多数 RMs 产生识别其他 IAV 亚型 HA 的交叉反应 IgG，且可通过流式细胞术在接种者 PBMC 中识别 HA 特异性 B 细胞。结果表明：HA 头域（head domain）接种可增强强效 HPAI-nAb 应答，仅 HA stem 倾向诱导非中和结合抗体；荧光标记 HA 探针可支持 HPAI-nmAb 分离。上述发现有助于利用 HA head 特异性抗体强效中和能力，开发新型疫苗与 nmAb 药物用于人类 HPAI 防治。
研究背景方面，H5N1 与 H7N9 这类高致病性禽流感（Highly Pathogenic Avian Influenza，HPAI）对人类健康威胁巨大，具备大流行潜力，人类感染病死率可达 40–50%。过去五年 H5N1 泛动物流行造成数亿鸟类及数万哺乳动物死亡，当前流行株对哺乳动物细胞趋向性增强、跨物种传播能力上升。现有措施存在局限：季节性流感疫苗仅含 H1N1 与 H3N2 等，对 HPAI 反应差；已获批 H5N1 疫苗所用毒株较旧，且难交叉中和 H7N9；神经氨酸酶（Neuraminidase，NA）抑制剂类治疗药物效力有限、易耐药、副作用明显。因此，研究人员需要在非人灵长类体内探索可同时覆盖 H5N1 与 H7N9、并能支持中和单克隆抗体（neutralizing monoclonal antibodies，nmAbs）开发的接种策略。该研究发表于《Viruses》。
关键技术方法上，研究人员使用威斯康星国家灵长类中心来源的六只 IAV 初始阴性印度恒河猴（Rhesus Macaques，RMs），其中部分既往为 SIV 感染精英控制者，分为三组接受 mRNA-脂质纳米颗粒（mRNA-Lipid Nanoparticles，mRNA-LNPs）与重组 5 型腺病毒（recombinant Adenovirus type 5，rAd5）序贯初免-加强-加强接种，分别靶向 HA stem、全长 HA 或仅 H5N1 HA。免疫原性通过 HA 三聚体/stem 的 IgG ELISA、慢病毒假病毒（Pseudotyped Viruses，PSVs）中和实验、活 H5N1 空斑减少中和试验（Plaque-Reduction Neutralization Tests，PRNTs）、流式细胞术检测 PBMC 中 HA 特异性 B 细胞来评估。
研究结果如下。2.1 节 HPAI HAs Are Efficiently Expressed from mRNA-LNPs and rAd5 Vectors In Vitro：研究人员在 Expi293F 细胞中验证载体表达，发现全长 HA 在 mRNA-LNPs 与 rAd5 中表面表达水平高于膜结合 HA stem。2.2 节 HPAI HA Vaccination Elicits H5N1- and H7N9-Binding Abs in RMs：通过纵向 HA 三聚体与 stem IgG ELISA，研究人员发现全长 HA 组结合抗体滴度最高，HA stem 组较低，仅 H5N1 组对 H7N9 交叉反应弱，一名丧失 SIV 控制的动物抗体应答衰减。2.3 节 HPAI HA Vaccination Elicits Binding Abs That Cross-Reactive with the HAs of Seasonal Influenza and LPAI Subtypes：ELISA 显示各组对 H1N1 有结合 IgG，HA stem 组 H3N2 结合最强，全程接种后多数动物对 H6N2、H9N2、H10N8 低致病性禽流感（Low Pathogenicity Avian Influenza，LPAI）HA 也出现结合 IgG。2.4 节 Vaccination with Full-Length HAs, but Not Membrane-Bound HA Stems, Elicits H5N1- and H7N9-nAbs in RMs：PSV 与 PRNT 中和实验表明，仅全长 HA 组产生强 H5N1/H7N9 中和抗体，HA stem 组虽有结合 IgG 但几乎无中和活性；H5 三聚体结合与中和滴度正关联强于 stem 结合。2.5 节 Vaccine-Induced Abs Cross-Neutralize Seasonal IAV Subtypes H1N1 and H3N2：PSV 中和显示接受全长 H5 HA 的动物出现 H1N1 中和，但滴度远低于 H5N1/H7N9；H3N2 中和仅少数动物轻微升高。2.6 节 HA-Specific B Cells Are Readily Detectable in Vaccinee PBMCs Using Fluorophore-Conjugated Recombinant HA Probes：荧光标记三聚体 HA 探针流式分析显示，全长 HA 组 H5/H7 特异性 B 细胞频率可达约 1% 或 0.6%，H5-only 组缺乏 H7 特异性 B 细胞，H3N2 特异性 B 细胞总体缺失。
讨论部分总结：研究人员指出，IAV 初始阴性灵长类经三剂异源模态接种可获得强效 de novo 中和抗体，原始抗原原罪（Original Antigenic Sin）可能限制人类应答；HA stem 虽保守但免疫原性与中和效能弱，全长 HA head 是主要中和贡献区；SIV 精英控制未明显损害异源抗原抗体应答，但免疫低下会削弱接种效果；人类普遍存在 IAV 预存免疫，因此结果不能直接外推人群。研究局限包括样本小、未评估呼吸道黏膜免疫、未用 head-only 免疫原、载体顺序可能影响结果。
结论部分翻译：在本概念验证研究中，研究人员评估了由编码 H5N1 与 H7N9 全长 HA 及/或 HA stem 域的核酸疫苗组成的三套 HPAI 定向接种方案在 RMs 中的免疫原性与纵向体液免疫。除两只接种者产生高滴度 H5N1 与 H7N9 中和抗体外，结果还揭示 IAV 初始阴性个体中 HPAI HA 疫苗诱导抗体应答的发生学及其他 IAV 亚型交叉反应特征。结果表明，动物体内对 H5N1、H7N9 及 H1N1 的 IAV 中和活性主要由 HA head 特异性抗体介导，许多疫苗诱导的 HA stem 特异性抗体缺乏强效中和能力。由于各组样本量小，仍需更大规模接种试验与活病毒攻击研究验证保护效力；未来还应评估鼻咽与支气管肺泡灌洗样本中的呼吸道黏膜抗体。结果显示核酸疫苗可在灵长类中诱导体外强效双亚型 HPAI 中和抗体，并为分离开发强效 HPAI-nmAbs 用于人类预防与治疗提供依据。
