《Biology》：Transcriptome Sequencing and Differential Expression Analysis of Ovaries from Kazakh Mares During Seasonal Quiescence and Estrus Activation
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哈萨克马为典型季节性繁殖动物，其生殖活动受季节环境变化强烈影响。非繁殖季卵巢活动显著降低。激素处理可在该时期诱导卵巢反应，但相关早期分子变化仍不完全清楚。研究人员比较了非激素刺激的季节静止母马与同一季节乏情期内经氯前列醇（cloprostenol）和马绒毛膜促
哈萨克马为典型季节性繁殖动物，其生殖活动受季节环境变化强烈影响。非繁殖季卵巢活动显著降低。激素处理可在该时期诱导卵巢反应，但相关早期分子变化仍不完全清楚。研究人员比较了非激素刺激的季节静止母马与同一季节乏情期内经氯前列醇（cloprostenol）和马绒毛膜促性腺激素（equine chorionic gonadotropin，eCG）处理后出现卵巢激活的母马卵巢基因表达。大量差异表达基因与免疫调节、代谢过程和生殖功能相关。C1QB、CREB5和IRS1因其差异表达及与相关生物学通路的关联而被作为转录组候选基因；但其功能作用未在本研究中验证。重要的是，激素诱导组并不代表性自然过渡到繁殖季生殖活动或稳定自然发情状态，所观察转录差异可能反映卵巢功能反应及激素处理的直接或间接效应。研究发现：在FDR < 0.05且|log2FC| > 1标准下，两组间共鉴定2119个差异表达mRNA和530个差异表达lncRNA；FDR校正GO和KEGG富集分析显示免疫调节、细胞通讯、代谢过程和生殖功能显著变化；KEGG显著富集补体凝血级联、细胞因子–细胞因子受体相互作用、趋化因子信号通路、PI3K–Akt信号通路及卵巢类固醇生成相关通路（q ≤ 0.05）。研究人员用RT-qPCR对选定DEG检测，表达趋势与RNA-seq一致，用作技术一致性评估。因DY组为季节乏情期药理诱导且在超声确认卵巢激活后不久取组织，该转录谱应解释为早期激素应答状态而非稳定发情状态；又因未纳入繁殖季未处理自然周期母马，内源季节效应不能与激素药理效应区分。
研究背景方面，马是典型长日照季节性多周期动物，哈萨克马作为中国重要地方品种，冬季乏情期卵巢活动明显下降，春季和夏季才恢复周期性卵泡发育与排卵。卵巢作为雌性生殖调控中枢，负责卵泡发育、卵母细胞成熟及雌激素和孕酮等类固醇激素合成分泌。季节性卵巢静止不仅是卵泡活动减少，而是内分泌反应性、细胞信号、代谢和局部卵巢组织互作协同改变的状态；而从静止转向可应答状态需要卵泡生长、类固醇生成、细胞间通讯和组织重塑的协调恢复。已有山羊、大鼠等物种研究揭示生殖状态转换伴随广泛转录重编程及下丘脑–垂体–性腺（hypothalamic–pituitary–gonadal，HPG）轴神经内分泌调控，但马在季节乏情期经实验激素诱导后卵巢早期转录响应仍知之甚少。由于自然繁殖季活动与药理诱导活动生理上不等价，若只比较诱导组与未诱导静止组，难以区分内源季节机制与药物效应，这正是本研究要谨慎处理并明确说明的空白。
研究人员开展的研究为：2025年2月新疆塔城哈萨克马季节乏情期，设非激素刺激季节静止组（DB组，n = 6）与氯前列醇加eCG诱导后具主导卵泡（≥35 mm）及发情行为表现的卵巢激活组（DY组，n = 6），取屠宰后卵巢组织进行链特异性转录组测序与生物信息学分析，旨在刻画季节静止与实验诱导早期卵巢应答状态的转录组差异，而非复现自然季节转换机制。
论文发表于《Biology》。该研究意义在于首次在哈萨克马中给出季节乏情期激素诱导卵巢早期全转录组图景，指出免疫、代谢、通讯和生殖通路共同重塑，并提醒后续研究必须加入繁殖季自然周期对照才能分离季节内源调控与药理响应，为假设驱动研究提供基线。
主要关键技术方法概括如下：样本为新疆塔城同一设施分栏饲养、统一饲喂苜蓿和玉米粒的12匹哈萨克母马，分DB与DY两组各6匹；采用rRNA去除的链特异性转录组建库与Illumina NovaSeq X Plus双端150 bp测序；用fastp质控、Bowtie2去rRNA、HISAT2比对马参考基因组、StringTie重构转录本并借CPC2、CNCI、FEELnc预测新lncRNA；Salmon定量，DESeq2按原始计数以FDR < 0.05且|log2FC| > 1筛差异mRNA与lncRNA；GO与KEGG富集以q ≤ 0.05为显著；选6个差异mRNA用GAPDH和β-actin归一化做RT-qPCR趋势一致性评估。
3.1. RNA-Seq Data Analysis：研究人员对12个卵巢cDNA文库统计，获得约1.33×1011高质量读数，单库平均约1.11×1010，Q20超99.10%、Q30超96.34%，参考基因组比对率均超94.61%，说明数据量和质量满足下游分析。
3.2. Analysis of Expression Patterns of Ovarian Tissue Samples from Kazakh Horses：通过主成分分析（principal component analysis，PCA）、小提琴图与样本间相关性分析，mRNA中PC1和PC2解释91.6%与5.0%方差，lncRNA中解释99.1%与0.8%，组间分离明显、组内聚拢；mRNA样本间相关系数>0.97，lncRNA>0.92，组内高于组间，证明重复性好、两类RNA均具清晰组间差异。
3.3. Analysis of Differential Expression Patterns of Ovarian Tissue Samples from Kazakh Mares：按FDR < 0.05且|log2FC| > 1，得2119个差异mRNA（1168上调如PLK2、COCH，951下调如LUM、FOS）与530个差异lncRNA（412上调如MSTRG.2874，118下调如MSTRG.4106），聚类热图显示两组表达模式截然不同。
3.4. GO Functional Annotation and KEGG Enrichment Analysis of Differentially Expressed Genes in the Ovarian Tissue of Kazakh Horses：3.4.1中差异mRNA显著富集细胞过程、生物调节、代谢过程、刺激响应、免疫系统过程、发育与生殖过程，以及膜、胞外区、结合、催化、转运和信号转导等功能；KEGG显著富集补体凝血级联、造血细胞谱系、细胞因子–细胞因子受体相互作用、趋化因子信号、自然杀伤细胞介导细胞毒性和吞噬体等，说明免疫炎症相关是核心特征，但感染相关通路仅反映共享免疫基因而非病原暴露。3.4.2中对差异lncRNA靶基因预测后富集到细胞过程、补体凝血级联、细胞因子–细胞因子受体相互作用、趋化因子信号、PI3K–Akt信号、Toll样受体信号、细胞外基质（extracellular matrix，ECM）–受体互作和卵巢类固醇生成，因未做lncRNA–mRNA共表达，不能推定直接调控。
3.5. RT-qPCR Assessment of RNA-seq Expression Concordance：研究人员对6个差异基因做RT-qPCR，以GAPDH和β-actin为内参，表达方向与RNA-seq一致且有统计学差异，仅作为技术一致性支持，不代表对C1QB、CREB5、IRS1的功能验证。
讨论部分总结：研究人员强调DY与DB差异是广泛转录重编程而非单基因变化，免疫、细胞/ECM通讯、代谢生长信号与生殖类固醇过程交织；C1QB属补体相关候选，不能由批量组织数据证明源于巨噬细胞或驱动激活；CREB5关联细胞和代谢信号，但证据多来自小鼠和人，不能外推哈萨克马；IRS1处PI3K–Akt网络中，是胰岛素/IGF信号到PI3K–Akt的环节之一，但无因果证明；卵巢类固醇生成富集仅为转录关联，未测激素浓度。局限包括每组仅6匹、无繁殖季自然周期对照、eCG到取样间隔未前瞻记录、批量组织不能分细胞类型、候选基因未功能验证、lncRNA缺共表达与功能实验。跨物种比较显示卵泡发育、代谢与类固醇转录改变可能部分保守，而补体/细胞因子强势信号可能混合卵巢生物学、品种、组织构成与药理诱导。
结论部分翻译：本研究表征了同一季节乏情期内，非激素刺激季节静止卵巢与激素诱导早期应答卵巢之间的转录组差异。FDR校正差异表达与富集分析识别出涉及免疫相关通路、代谢信号、细胞通讯和生殖过程的变化。C1QB、CREB5和IRS1因其差异表达及通路关联被优先作为转录组候选基因；但其功能作用未在本研究确立。显著的免疫相关转录特征可能反映卵巢组织重塑、对激素刺激的急性响应或二者组合。因未纳入自然周期繁殖季母马且DY样本代表早期激素应答状态，所观察分子差异不能被解释为调控自然季节生殖激活的具体机制或稳定发情状态特征。需借助适宜季节对照、纵向采样、靶向表达验证和功能实验的后续研究，来区分内源季节调控与药理响应，并确定所识别候选基因的生物学作用。
