《Vaccines》：A Ganoderma lucidum Polysaccharide-Modified Nanoadjuvant Elicits Potent Cellular Immunity for Hepatitis B Vaccine
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背景：铝佐剂乙型肝炎疫苗能有效预防原发性HBV感染，但主要偏向体液免疫，诱导强细胞免疫应答的能力有限。为提高免疫应答质量，研究人员开发了一种灵芝多糖修饰的杂合纳米颗粒佐剂（GHNP），用于乙型肝炎表面抗原（HBsAg）疫苗接种。方法：研究人员以不同质量比将阳离
背景：铝佐剂乙型肝炎疫苗能有效预防原发性HBV感染，但主要偏向体液免疫，诱导强细胞免疫应答的能力有限。为提高免疫应答质量，研究人员开发了一种灵芝多糖修饰的杂合纳米颗粒佐剂（GHNP），用于乙型肝炎表面抗原（HBsAg）疫苗接种。方法：研究人员以不同质量比将阳离子PEG-PCL/DOTAP杂合纳米颗粒（HNPs）进行灵芝多糖（GLP）表面修饰，并通过粒径、多分散指数、Zeta电位和透射电子显微镜进行表征。在体外评估了抗原摄取、RAW264.7细胞活力、MHC II表达以及TLR2/4相关的TNF-α分泌。在第0、14和28天，用PBS、HBsAg、HBsAg+铝佐剂、HBsAg@HNP或HBsAg@GHNP6对C57BL/6小鼠进行肌肉注射免疫。评估了HBsAg特异性抗体、脾细胞活化、增殖和细胞因子分泌。结果：GHNP6表现出合适的理化性质，在高达10 μg·mL?1的浓度下具有可接受的细胞相容性，并能高效摄取模型抗原。GHNP增加了RAW264.7细胞中MHC II的表达，TLR2/4抑制可减少纳米颗粒相关的TNF-α分泌，支持这些通路参与免疫激活。在体内，HBsAg@GHNP6诱导了强烈的HBsAg特异性IgG应答，且IgG2a/IgG1比值高于HBsAg@HNP和HBsAg+铝佐剂。在HBsAg再刺激后，该组还产生了最高的脾细胞增殖，其IL-6分泌低于HBsAg+铝佐剂组，而IFN-γ与PBS和游离HBsAg组相比适度升高。结论：GHNP将纳米颗粒辅助的抗原递送与GLP介导的免疫调节相结合，代表了一种在HBsAg疫苗接种中增强细胞免疫应答同时维持体液免疫的有前景策略。
乙型肝炎病毒（HBV）感染仍是全球重大公共卫生挑战。现有铝佐剂重组乙型肝炎疫苗虽能有效预防原发性感染，但铝佐剂作为经典Toll样受体（TLR）非依赖的Th2偏向佐剂，主要诱导以IgG1为主的体液免疫，难以激活Th1型细胞免疫和CD8
+细胞毒性T淋巴细胞（CTL）应答，也无法清除已建立的细胞内潜伏感染。老年、肥胖及免疫功能低下人群对该疫苗的应答率尤其偏低。因此，打破铝佐剂的“Th2-only”免疫天花板，开发能同时激发体液免疫和Th1型细胞免疫的新型佐剂系统，是乙肝疫苗研发领域的迫切需求。尽管分子佐剂和纳米载体递送系统已被广泛探索，但纳米载体本身对免疫亚型的调控能力有限，主要依赖非特异性膜相互作用和增强抗原摄取，难以精确调节Th1/Th2平衡。灵芝多糖（GLP）作为天然免疫调节分子，具有Th1/Th2双向调节甚至Th1偏向潜力，且低毒、安全性好，但将其用作乙肝疫苗佐剂的系统研究尚少。基于此，研究人员提出假设：将GLP吸附修饰到聚乙二醇-聚己内酯（PEG-PCL）/1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷（DOTAP）阳离子杂合纳米颗粒表面，形成GLP修饰的杂合纳米佐剂（GHNP），可同时发挥纳米载体高效递送抗原和GLP主动免疫调节的双重功能。研究人员开发了GHNP，并系统评价了其理化性质、体外抗原呈递细胞（APC）活化、TLR2/4通路参与以及在小鼠模型中的免疫效果。结果表明，GHNP在维持体液免疫的同时显著增强了细胞免疫，尤其提高了IgG2a/IgG1比值和脾细胞增殖，为乙肝疫苗佐剂设计提供了新策略。相关论文发表于《Vaccines》。
研究人员采用的主要技术方法包括：从云南省楚雄彝族自治州大姚县采集并经中国科学院微生物研究所鉴定的灵芝中提取纯化GLP；以纳米沉淀法制备PEG
5k-PCL
13k/DOTAP阳离子杂合纳米颗粒（HNP），通过表面吸附不同质量比的GLP制备系列GHNP；采用动态光散射（DLS）和透射电子显微镜（TEM）表征粒径、Zeta电位及形貌；以FITC-BSA为模型抗原，用流式细胞术检测RAW264.7细胞摄取效率；用CCK-8法检测细胞活力；用流式细胞术检测MHC II表达；用ELISA检测TNF-α，并通过TLR2拮抗剂CU-CPT22和TLR4拮抗剂TAK-242验证信号通路。体内实验使用6-8周龄雌性C57BL/6小鼠，随机分为PBS、游离HBsAg、HBsAg+铝佐剂、HBsAg@HNP和HBsAg@GHNP6组，在第0、14、28天肌肉注射免疫，ELISA检测血清HBsAg特异性IgG及其亚类；第42天分离脾细胞进行HBsAg再刺激，用流式细胞术分析淋巴细胞亚群和活化标志物，用CCK-8法检测增殖，用ELISA检测IFN-γ和IL-6。
3.1 制备与表征
通过DLS和TEM表征发现，HNP和不同GHNP的水合粒径均约200 nm，PDI显示分散性良好；随GLP修饰比例增加，Zeta电位逐渐降低，表明带负电的GLP成功吸附到阳离子HNP表面，且未发生电荷反转；GHNP6形貌致密、无明显聚集，具备后续研究的基础。
3.2 GLP修饰比例对抗原摄取的影响
以FITC-BSA为模型抗原的摄取实验显示，游离BSA几乎不被细胞摄取，而HNP能有效促进抗原内化；GHNP24、GHNP12、GHNP6的摄取效率高于HNP和GHNP4，表明适度GLP修饰可增强抗原递送，过度修饰则会屏蔽阳离子电荷而不利于摄取。综合GLP载量和摄取效率，选择GHNP6为优选配方。
3.3 细胞活力
CCK-8结果显示，0.1-10 μg·mL
?1浓度范围内GHNP对RAW264.7细胞活力无抑制作用，甚至低浓度下代谢活性增强；100 μg·mL
?1时细胞活力显著下降，提示其安全浓度上限为10 μg·mL
?1。
3.4 APC活化和TLR2/4受体验证
流式结果显示，GHNP比HNP更显著提高MHC II阳性细胞比例和平均荧光强度，促进APC活化。TLR2/4拮抗剂实验显示，CU-CPT22预处理后HNP和GHNP的TNF-α分泌分别降低24.2%和28.8%，TAK-242预处理后分别降低34.6%和33.8%，表明TLR2/4通路参与了GHNP诱导的免疫激活，且GLP修饰增强了TLR2相关信号参与。
3.5 体内免疫
免疫期间各组小鼠体重正常增加，无明显系统性毒性。ELISA显示HBsAg@GHNP组在Day 14有更高的IgG趋势，Day 42总IgG均值最高但无统计学差异。亚类分析显示，HBsAg@GHNP组的IgG2a/IgG1比值高于HBsAg@HNP和HBsAg+铝佐剂组，提示Th1偏向的体液应答。
3.6 脾细胞活化和细胞因子检测
流式结果显示，
