《Vaccines》：Research Progress, Application, and Industrialization Prospects of Circular RNA Vaccines in Viral Diseases
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RNA疫苗——包括线性信使RNA（mRNA）、自我扩增RNA（saRNA）和环状RNA（circRNA）——构成了下一代病毒性疾病防控的核心平台；其中，circRNA疫苗具备显著的结构稳定性，但其技术瓶颈和在兽医学中的应用前景尚未得到系统综述。本综述综合了当前
RNA疫苗——包括线性信使RNA（mRNA）、自我扩增RNA（saRNA）和环状RNA（circRNA）——构成了下一代病毒性疾病防控的核心平台；其中，circRNA疫苗具备显著的结构稳定性，但其技术瓶颈和在兽医学中的应用前景尚未得到系统综述。本综述综合了当前关于circRNA疫苗设计、环化策略、翻译机制、递送系统和免疫学结果的研究，并将其抗病毒性能与线性mRNA疫苗进行了比较。由于其共价闭合环状构象，circRNA疫苗表现出更强的核酸酶抗性和优异的热稳定性，能够在室温下维持持续的转染活性而无需依赖严格的冷链；通过内部核糖体进入位点（IRES）或N6-甲基腺苷（m6A）修饰驱动的非帽依赖性翻译，并结合优化的环化方案和脂质纳米颗粒（LNP）载体，circRNA疫苗相较于线性mRNA疫苗可诱导显著更高的抗病毒IgG滴度和持久的抗原特异性T细胞记忆。这些疫苗已被应用于新型冠状病毒病（COVID-19）、猴痘、流感和家畜病毒性疾病的防治，展现出对病毒变异的强适应能力以及与黏膜或无针给药途径的兼容性。CircRNA疫苗既适用于突发疫情应急响应，也适用于常规免疫规划；然而，挑战依然存在，包括长序列环化效率低、制造成本高以及质量控制标准不完善。通过改进生产工艺和开发适应资源有限环境的递送技术来解决这些问题，对于将circRNA疫苗确立为家畜疾病管理的支柱产品以及应对新兴人畜共患病的战略储备至关重要。
1. 引言
RNA疫苗作为核酸疫苗的重要分支，在COVID-19大流行期间实现了从基础研究到大规模产业化的飞跃，展现了快速设计、灵活迭代、无细胞大规模生产以及能够同时诱导体液免疫和细胞免疫等多重优势。传统疫苗在常规传染病控制中取得了显著成功，但在应对快速突变的病原体和突发疫情方面面临挑战。在此背景下，RNA疫苗“即插即用”（即抗原序列可直接替换而无需重新设计核心circRNA骨架和生产流程）的平台特性赋予了其独特的战略价值。然而，线性信使RNA（mRNA）本质上对核酸酶敏感且依赖冷链物流，尽管核苷修饰和脂质纳米颗粒（LNP）递送技术带来了安全性和有效性的提升，但仍存在体内半衰期短、热稳定性不足以及某些系统性不良反应发生率较高等未解决的局限性。这些核心瓶颈推动了对下一代RNA疫苗平台的持续探索。
目前，自我扩增RNA（saRNA）和环状RNA（circRNA）已成为两个主要发展方向。saRNA通过细胞内自我扩增降低了所需给药剂量，但其更长的序列增加了制造复杂性和工艺难度。相比之下，circRNA具有共价闭合环状结构，赋予其比线性mRNA更强的核酸酶抗性和显著延长的半衰期，使其能够在体内实现更持久的抗原表达。它通过内部核糖体进入位点（IRES）或N6-甲基腺苷（m6A）修饰启动翻译，可以减少甚至消除对核苷修饰的需求并简化生产过程；同时在室温储存两周后仍能保持稳定的转染效率，在热稳定性方面展现出突出优势。尽管如此，该领域仍存在若干分歧观点和未解决的争议：circRNA固有的先天免疫原性仍存争议，不同研究体系得出的结论不一致；主流的环化策略在生产产量、杂质谱和工业可扩展性方面差异巨大，尚未就通用的规模化技术路线达成共识；IRES元件的组织依赖性活性也导致不同应用场景下的翻译效率异质性。近期，将自我复制元件整合到circRNA骨架中已成为一个有前景的探索方向，但相关研究仍处于初步阶段。
本综述的主要焦点是circRNA疫苗平台，以线性mRNA疫苗和saRNA疫苗作为对照技术路线进行比较分析，系统总结了面向目标的circRNA疫苗设计的核心策略、关键技术突破、未解决瓶颈和转化前景。总体而言，自我复制的circRNA在免疫原性、热稳定性和生产成本控制方面展现出综合优势，被认为是一种极具前景的下一代RNA疫苗技术，具有突出的产业化潜力；然而，长序列环化效率、标准化质量控制系统和递送系统适应性仍然是制约其临床和产业转化的主要瓶颈。本综述旨在为下一代RNA疫苗的研发和转化应用提供参考。
2. RNA疫苗技术概述
2.1. mRNA疫苗的技术特点
线性mRNA疫苗是非复制型RNA，其典型结构由5′帽结构、5′非翻译区（5′-UTR）、病毒抗原开放阅读框（ORF）、3′-UTR和多聚腺苷酸尾（poly(A)）组成。其序列模块化程度高，可快速更换来自不同病毒的抗原基因，以满足多种病毒性疾病的防控需求。线性mRNA热稳定性差，高度依赖冷链储存、运输和递送系统；其体内半衰期短，抗原表达持续时间有限，通常需要多次免疫；对病毒变异的适应性不足，难以应对快速突变的新发和突发病毒性疾病。
2.2. saRNA疫苗的技术特点
自我扩增RNA是含有病毒复制相关元件、抗原编码序列和体外转录（IVT）骨架的复制型RNA。其骨架多由甲病毒基因组改造而来，全长约9-12 kb。除了线性mRNA的基本元件外，它还携带非结构蛋白1-4（nsP1-nsP4）的编码区和亚基因组启动子，使其能在宿主细胞内进行自我扩增而不产生感染性病毒颗粒，因此安全性相对较高。saRNA进入细胞质后翻译产生nsP1-nsP4，组装成RNA依赖性RNA聚合酶（RdRP），启动细胞内自我扩增，产生大量编码病毒抗原的亚基因组RNA，实现高效和持久的抗原表达，显著增强免疫原性，并以低剂量诱导强大的抗病毒免疫。saRNA序列长、结构复杂，导致合成工艺复杂、大规模生产成本高；在共感染病毒存在的情况下，甲病毒复制子的saRNA可能与病毒RNA重组产生新型或变异毒株。同时，由于其复制机制诱导的细胞毒性效应，saRNA会导致细胞损伤和宿主细胞活力受损。
2.3. circRNA的结构与生物合成
circRNA是通过反向剪接形成的共价闭合单链RNA（ssRNA），其中下游5′剪接供体位点与上游3′剪接受体位点共价连接，因此没有游离的5′帽或3′多聚腺苷酸尾，这使其比线性RNA更稳定，不易被核酸外切酶降解。与mRNA类似，天然circRNA包含非编码区和蛋白质编码区。根据序列来源，可分为外显子型、内含子型和外显子-内含子混合型。在真核生物中，circRNA主要通过反向剪接形成。目前体外合成circRNA的主要方法是将线性RNA前体的末端连接形成共价闭合环，采用化学合成和酶促策略两种方法。由于纯化成本高、产率低，化学合成只能产生长度小于50至70个核苷酸的RNA。酶促策略通常通过IVT反应实现。circRNA研究的最佳实践质量控制标准涵盖六个模块：纯化和表达谱分析、circRNA验证与定量、原位杂交检测、circRNA敲低、circRNA过表达以及调控机制研究。
2.4. 内源性非编码circRNA的功能
研究发现，内源性非编码circRNA SMARCA5可与宿主基因位点结合形成R-loop，导致SMARCA5在外显子15处提前转录终止，下调全长基因表达并产生截短的、无功能的异构体；同时，circSMARCA5的过表达可显著增强乳腺癌细胞对细胞毒性药物的敏感性。研究证实，内源性非编码circRNA通过充当竞争性内源RNA（ceRNA）发挥生物学功能，可作为miRNA海绵参与转录后基因调控。缺乏5′帽和3′尾的内源性非编码circRNA只能通过非帽依赖性机制完成翻译，主要翻译机制是m6A介导和IRES介导的翻译。研究发现内源性非编码circRNA ZNF609具有翻译潜能，但其翻译的调控机制以及翻译延伸和终止的过程仍未完全阐明。
2.5. circRNA的疫苗相容特性
circRNA广泛存在于真核细胞和病毒基因组中，是一种潜在的疫苗佐剂，具有独特优势。研究表明，当外源性circRNA与可溶性蛋白共同递送时，可有效诱导抗原特异性抗体产生和T细胞活化。它可以直接激活RNA模式识别受体RIG-I，促进接头蛋白MAVS的丝状化以及下游转录因子IRF3的活化，从而增强免疫反应的强度和持续时间。同时，众多研究证明了circRNA在激活先天免疫细胞和树突状细胞以及递送编码蛋白抗原方面的优势。此外，细胞和动物模型的临床前研究表明，与线性RNA相比，circRNA表现出更高的翻译持久性。通过优化体外合成的环状mRNA，工程化circRNA在体外可产生比mRNA更多的蛋白质，并在体内外均表现出更高的翻译持久性。值得注意的是，在间隔两周后再次给予circRNA，其表达未见显著下降，支持了circRNA在同一受试者中重复使用的可行性。将IRES引入载体用于circRNA的异位表达或在体外合成的circRNA载体中，已在细胞和动物中实现高效的蛋白质翻译。circRNA不一定需要核苷修饰，现有临床前证据表明其可能具有比核苷修饰的线性mRNA更低的固有先天免疫激活水平，但相关安全性结论仍有待在临床试验中验证。
2.5.1. 产业化比较：circRNA与线性mRNA
从产业化角度看，线性mRNA疫苗已建立了高度成熟和标准化的GMP制造工作流程，拥有完善的工艺控制系统，涵盖体外转录和多级纯化等核心步骤，所有关键工序都有明确的产量和纯度验收标准，形成了广泛认可的工业生产和成本基准。相比之下，circRNA生产需要在线性前体合成的基础上增加一个额外的环化步骤。当前主流的环化策略包括化学合成、T4 RNA连接酶连接、基于I组内含子自剪接的排列内含子-外显子（PIE）系统以及II组内含子自剪接环化系统，各自在适用序列长度、外源序列残留和免疫原性方面各有优劣。抗原编码序列通常超过1 kb，易受RNA二级结构干扰，显著增加了环化难度。circRNA经IVT结合自剪接或酶促环化合成的粗产物是一个由多种组分组成的复杂体系，包括未环化的线性前体、完整环状RNA、环状RNA多联体和切口损伤的环状RNA。目前的纯化策略采用RNase R消化去除线性前体，再结合多步尺寸排阻高效液相色谱（SE-HPLC）去除切口环状副产物，但这种组合工艺对纯度和产量的提升有限，且SE-HPLC存在严重的峰重叠问题。实验复制该纯化程序得到的最终产品纯度仅为41%，总收率为45%，整体回收率明显低于线性mRNA生产，且工艺复杂度更高，不适合大规模制造。因此，标准化的GMP制造尚未建立。目前，circRNA的生产成本显著高于线性mRNA。尽管circRNA通过环化支架优化、纯化流程简化和生产规模扩大具有长期降本潜力，但其整体产业成熟度仍远落后于线性mRNA平台，大规模生产和应用仍受到核心技术瓶颈的限制。
2.5.2. 质量控制标准与监管框架
对于线性mRNA疫苗，世界卫生组织（WHO）已发布专门的官方技术指南，为预防性mRNA疫苗的质量、安全性和有效性评估建立了系统的监管和质量控制框架，已将mRNA完整性、纯度、加帽效率、poly(A)尾长度和双链RNA（dsRNA）残留等关键质量属性纳入质量控制要求范围，并明确了从起始物料、过程控制到最终产品放行的全链条质量控制原则。环状RNA具有多样的拓扑结构和复杂的杂质谱，目前尚无统一的金标准用于其质量控制，需要通过多种正交技术进行全面表征。一项研究建立的多维分析体系包括变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、RNase R/RNase H消化测定、质谱法、高效液相色谱法和连接位点测序，分别可实现组分分离与定量、拓扑结构验证、分子量确认、纯度分析和序列保真度验证。
2.5.3. 临床转化进展
(1) 人类疫苗：环状RNA疫苗总体上仍处于早期研发阶段，现有研发项目主要集中在针对COVID-19的预防性疫苗和针对黑色素瘤的治疗性疫苗两方面，相关候选产品仅在小鼠和恒河猴等动物模型中验证了抗原表达效率、免疫原性和疾病保护效力，尚未进入临床试验。信使RNA疫苗已有产品作为COVID-19疫苗实现商业上市和正式批准，针对狂犬病、季节性流感、寨卡病毒和呼吸道合胞病毒等多种传染病的候选疫苗已推进至I期至IV期的不同临床阶段，临床转化路径较为成熟。
(2) 兽医疫苗：兽用mRNA疫苗普遍处于临床前研发阶段，针对口蹄疫病毒、狂犬病病毒、非洲猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒等多种重要动物疾病，已在动物模型中完成了免疫原性和攻毒保护效力的验证。早期文献鲜有报道兽用circRNA疫苗候选物，但近期已有数项临床前研究发表。几乎所有circRNA兽用疫苗仍处于临床前研究阶段，针对经典猪瘟病毒、新型鸭呼肠孤病毒等病原的候选物仅完成了靶动物的攻毒研究，尚未进入临床开发。
