CTLA-4单倍体不足导致小鼠迟发性自身免疫病理

《iScience》：CTLA-4 haploinsufficiency leads to late-onset autoimmune pathology in mice

　　

在人类中，CTLA4基因单个拷贝功能丧失会导致一种以免疫缺陷和自身免疫表现谱为特征的免疫疾病。为研究CTLA-4单倍体不足（haploinsufficiency）的致病性，研究人员利用携带患者来源Y139C突变的杂合（heterozygous）小鼠模型开展研究。研究人员发现，年轻杂合小鼠表现出淋巴增殖特征和活化的T细胞表型，但未出现自身免疫。共培养实验显示其trans-endocytosis功能受损。尽管存在该功能障碍，小鼠对诱导性炎症仍具抵抗性。然而随年龄增长，小鼠最终出现比同龄同窝对照更明显的自发性自身免疫表现。机制上，系统性活化诱导了CTLA-4非依赖性补偿通路，使Treg细胞保留抑制活性。该研究证实了Y139C杂合突变的致病性，为CTLA-4单倍体不足提供证据，并揭示针对trans-endocytosis受损而产生的补偿机制，可为疾病进展理解和治疗策略开发提供参考。

研究背景方面，免疫耐受对抑制过度免疫应答和维持免疫稳态至关重要。CTLA-4（cytotoxic-T-lymphocyte-antigen-4，细胞毒性T淋巴细胞抗原4）是重要免疫检查点分子，主要在Foxp3⁺调节性T（Treg）细胞和活化常规T（Tconv）细胞上表达，可通过向细胞内传递抑制信号并与CD28竞争抗原提呈细胞（APC）上的B7分子结合，抑制异常T细胞活化。CTLA-4单倍体不足是由杂合种系突变导致的罕见单基因免疫失调综合征，患者常有血液系统、甲状腺、肝、皮肤、肠和关节等自身免疫表现，也可见反复呼吸道感染和低丙种球蛋白血症等免疫缺陷。CTLA-4胞外配体结合域高度保守的MYPPPY基序对B7结合及trogocytosis和trans-endocytosis过程非常关键。研究人员此前鉴定到一名携杂合c.416A>G（p.Y139C）突变的CTLA-4单倍体不足患者，并证明Y139C纯合敲入小鼠出现致死性淋巴增殖病；但人类仅需杂合突变即可致病，因此研究人员构建Ctla4^Y139C/+杂合小鼠，探究杂合突变体内后果。该研究论文发表于《iScience》。

主要关键技术方法方面，研究人员使用CRISPR Cas9在C57BL/6J背景下构建Ctla4^Y139C小鼠，并联合Foxp3-GFP报告鼠、IL-10-GFP报告鼠、Rag2^?/?小鼠及CD45.1小鼠开展实验。样本包括6至8周幼龄鼠与18月龄老龄同窝鼠。关键方法主要有：DSS（dextran sulfate sodium，葡聚糖硫酸钠）诱导急性结肠炎与Rag2^?/?受体中Tconv移植慢性结肠炎及延后Treg过继转移；NP-KLH免疫评估体液免疫；李斯特菌（Listeria monocytogenes）感染评估抗感染能力；Treg与B细胞共培养评估trans-endocytosis；新鲜分选外周Treg批量RNA测序（bulk RNA-seq）；以Rag2^?/?为受体的骨髓嵌合小鼠解析外在炎症驱动效应。

研究结果方面，Generation and phenotype characterization of the CTLA-4 Y139C heterozygous mice小节显示，杂合鼠存活期与野生型同窝鼠相当，8周龄时代谢组织无结构异常和淋巴细胞浸润，血清IL-1β、TNF-α、IL-6、IFN-γ及IgG、IgM与野生型无差异，中性粒细胞淋巴细胞比也无显著改变，说明Y139C杂合突变在小鼠幼年期不引起自发自身免疫。

The CTLA-4 Y139C heterozygous mutation in mice leads to elevated basal activation of T cells小节显示，6周龄杂合鼠出现淋巴结病和脾大，CD4⁺与CD8⁺T细胞频率在淋巴器官中改变但绝对数脾内相当、淋巴结内升高；外周T细胞呈现初始细胞减少、效应细胞增多，CD4⁺T细胞IFN-γ升高，Tconv高表达ICOS和Ki67且体外TCR刺激增殖增强，表明杂合突变导致外周T细胞基础活化增强。

CTLA-4 Y139C heterozygous mice develop late-onset autoimmune manifestations小节显示，DSS结肠炎中杂合鼠并未更敏感，NP-KLH免疫后高亲和力NP特异性IgG/IgM无差异，李斯特菌感染后脾肝菌量相当；但18月龄杂合鼠血清促炎细胞因子、总IgG/IgM、抗dsDNA和抗组蛋白IgG升高，肾周血管淋巴细胞浸润、耳部表皮增厚、肾小球IgG沉积明显，证明Y139C杂合突变使小鼠易发生自发性迟发自身免疫。

CTLA-4 Y139C heterozygous Treg cells preserve their suppressive capacity despite impaired trans-endocytosis activity小节显示，杂合Treg频率升高，表面和循环CTLA-4表达正常；与野生型、纯合ki Treg相比，杂合Treg对B细胞CD80/CD86的trans-endocytosis部分受损，但体内APC表面B7未上调；体外抑制初始Tconv增殖能力与野生型相当，延后过继至慢性结肠炎模型反而比野生型Treg疗效更好；LAG-3、TIGIT、CD25、TGF-β、穿孔素、颗粒酶B无差异，而CD73和CD39上调，IL-10在Tconv和Treg中均升高，说明整体抑制功能被保留且有补偿。

Treg cells undergo compensatory adaptation in CTLA-4 Y139C heterozygous mice小节显示，直系杂合Treg转录组有2145个差异基因，干扰素响应基因、效应Treg相关基因、Th1相关基因富集；但在骨髓嵌合设置中，杂合Treg不再上调ICOS、Ki67、CXCR3、PD-1、GITR和CD73，转录差异不重现，抑制优势消失，说明直系杂合Treg的效应样和增强抑制表型由外在炎症环境驱动，而非突变本身直接造成。

讨论部分总结，CTLA-4单倍体不足为常染色体显性单基因病，患者Treg常有CTLA-4低表达和trans-endocytosis受损；本研究用Y139C杂合小鼠提供体内证据，证明单等位基因Ctla4突变足以破坏稳态并诱导迟发自身免疫。人类多于青少年发病而小鼠延迟发病，反映微生物暴露等环境与物种免疫调控差异；杂合鼠Treg高活化可在嵌合模型中逆转，说明是外在驱动适应。人类同一变异也可有无症状携带者，提示不完全外显，Y139C杂合小鼠适于研究发病触发机制和预后标志。

结论部分翻译为：Y139C杂合小鼠是研究CTLA-4单倍体不足致病、进展和补偿效应的有用模型。研究发现Ctla4杂合突变足以破坏免疫平衡并推动疾病进展，同时展现Treg细胞应对免疫失调的适应性可塑性。这些结果可为CTLA-4介导免疫疾病的诊断评估和靶向干预的合理设计提供依据。